基于UPLCQTOF/MSE技术的彝药满山香的化学成分鉴别研究

郝庆秀　康利平　朱寿东　金艳　郭兰萍

[摘要]利用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱技术（UPLCQTOF/MSE），对彝药满山香的化学成分进行在线快速分析鉴定。以水乙腈为流动相，梯度洗脱，ESI 正、负离子模式下采集数据，通过UNIFI数据库检索并人工复核相对分子质量、特征离子、中性丢失、色谱保留时间等信息，并结合对照品信息和文献报道等对其进行验证；对于未知成分，根据其精确相对分子质量、质谱裂解碎片、色谱保留行为以及已知同类化合物的特征碎片，对其进行结构推测，确定化学成分的结构。该研究共鉴定出包括原花青素B2、南五味子酸、五味子酯甲、异形南五味子丁素和戈米辛及其衍生物等68个化合物的结构，其中有37个首次在满山香中发现的化合物，1个待确定化合物。

[关键词]满山香； 化学成分； 鉴别； UPLCQTOF/MSE； UNIFI数据库

[Abstract]This study was to identify the chemical constituents of Schisandra propinqua， one herbal medicine of Yi nationality in China by using ultra performance liquid chromatographyquadrupoletime of flightmass spectrometry （UPLCQTOF/MSE） Acetonitrile water containing 01% formic acid was used as the mobile phase for gradient elution Data were collected under ESI negative mode and ESI positive mode， and then screened and verified by the software of UNIFI and Masslynx41 Based on the accurate mass， fragment ions， neutral losses， mass error， retention time， reference substance， isotope information， the intensity of fragments， as well as the previous reports， the known compounds were validated and identified The chemical structures of the unknown components were identified according to exact molecular weight， MS fragment， chromatographic retention behavior， and characteristic fragments of known congener compounds A total of 68 chemical components were identified from S propinqua， including 3 flavonoids， 10 flavanols， 34 lignans compounds （including 20 dibenzocyclooctene lignans）， 4 triterpenoids， 17 organic acid and other compounds 37 compounds of them were found in S propinqua for the first time， and one potential compound needed to be identified.

[Key words]Schisandra propinqua； Chemical constituents； identification； UPLCQTOF/MSE； UNIFI database

滿山香来源于木兰科植物合蕊五味子的干燥藤茎和根，为彝族常用药材，用于治疗骨折、慢性胃炎、风湿性关节炎、痛经、外伤出血等。《明代彝医书》记载满山香主要作用于疟疾。满山香根茎提取物的复方注射液临床用于治疗肺癌，以满山香为原料的灯银脑通胶囊用于中风中经络、瘀血阻络的治疗。目前，地方药材标准及彝药文献[13]中没有规定满山香质控的化学成分，也未见有对其整体化学成分研究的报道。满山香药材中仅报道了gomisin，kadsulignan L，intermedia A，五味子丙素，β谷甾醇，胡萝卜苷，查尔酮，三十烷酸，红景天苷，对甲氧基苯甲酸等成分[46]。LCMS技术可以在高分离度的情况下提供化合物的相对分子质量和结构式的相关信息，避免了繁杂的分离制备，为中药化学成分的分析和鉴定提供了快速有效的手段[78]。本研究利用UPLCQTOF/MSE技术，对彝药满山香整体的化学成分进行表征，鉴定了主要的化学成分，可为其质量标准研究提供潜在的化学标志物，也为有效地开发和利用彝药满山香药材资源提供了科学依据。

1材料

满山香样品采集于云南楚雄彝族自治州，经中国中医科学院金艳老师鉴定为木兰科植物合蕊五味子Schisandra propinqua （Wall） Baill var intermdida A C Smith，原植物标本现保存于中国中医科学院中药资源中心。

Acquity UPLCIClass串联XevoG2S QTOF质谱联用仪，配有Masslynx 41质谱工作站（Waters公司，美国），分析天平（梅特勒托利多，瑞士），离心机（Eppendorf公司，德国），KQ100DE超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），02 μm注射器式滤器（Pall公司，美国）。endprint

色谱级乙腈、甲醇、甲酸（Merck公司，德国）；超纯水为MilliQ纯水系统制备，（电阻≥182 MΩ，Millipore 公司，美国）；五味子丙素（批号20130510）、原儿茶酸（批号20130511），由北京北研馨绿生物技术有限公司提供；儿茶素（批号BW60219）、芦丁（批号12040302），购自成都曼思特生物科技有限公司；异形南五味子丁素（批号17070723），北京万佳首化生物科技有限公司提供；内南五味子酯C（批号RN039170120，）南五味子酸（批号RN047170120），原花青素B2（批号YF33150801），北京融城鑫德科技有限公司提供；戈米辛J（批号 161227），戈米辛H（批号161250），五味子醇乙（批号170119），英联科技（北京）有限公司提供；以上对照品纯度≥98%。

2方法

21样品溶液及对照品溶液制备

样品经干燥、粉碎，过40目筛，精密称取01 g，加70%甲醇20 mL，室温超声提取2次，每次30 min，12 000×g离心10 min，取上清液经02 μm 滤膜过滤，备用。分别精密称取适量对照品，加甲醇超声溶解，4 ℃避光保存，备用。

22实验条件

221色谱条件色谱柱为Acquity UPLC BEH C18 （21 mm×100 mm，17 μm）；流动相乙腈（A） 01%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～2min，5%～20% A；20～65 min，20%～40% A；65～70 min，40%～65% A；70～105 min，65%～75% A；105～11min，75%～90% A；110～120 min，90%～100% A；120～130 min，100%A）；柱溫35 ℃；流速500 μL·min-1；进样量10 μL。Acquity UPLC PDA 检测器，波长范围190～400 nm。

222质谱条件数据采集模式：分别在正离子（ESI+）、负离子（ESI-）条件下，Continuum 模式数据采集，扫描范围m/z 50～1 200，以亮氨酸脑啡肽做校正液；毛细管电压05 kV（ESI+），20 kV （ESI-）；锥孔电压40 V，电离源温度120 ℃，脱溶剂温度450 ℃；脱溶剂气流速900 L·h-1。低能量通道碰撞能量为6 eV，ESI-高能量扫描碰撞能量为40～70 eV，ESI+高能量扫描碰撞能量为25～ 45 eV。

23数据处理

建立了满山香药材的化合物库（通过整理已报道的五味子属化合物的结构式），导入UNIFY 17软件中，并与UNIFI 17软件自带的中药化学成分数据库合并建立数据库，然后进行化合物峰提取和自动匹配鉴定，并与对照品的色谱和质谱信息进行比对，确证所匹配化合物的结构以及其相应碎片信息，鉴定彝药满山香的化学成分。同时，利用MassLynx 41工作站以及SciFinder，Chemspider等数据库在线检索，以及文献报道的相关数据，对彝药满山香的化学成分进行结构确认。

3结果

31实验条件优化

为全面表征满山香药材的化学成分，本研究分别用纯水、不同浓度的乙醇、甲醇水溶液作为提取溶剂，对满山香药材的化学成分进行提取，通过比较不同提取溶剂提取物的色谱分离度和质谱高低能量下的离子信息情况，对色谱分离条件、质谱条件进行了优化，见21，22项。满山香提取物的UPLCQTOF/MSE基峰离子流（BPI）色谱图见图1。

32化合物鉴定

建立UNIFY分析方法：设定预期成分 （导入满山香数据库），设置3D 峰检测参数的强度阈值和加合离子峰的种类，负离子模式下加合离子为[M-H]-，[M+HCOO]-，[M+Cl]-，[2M-H]-；正离子模式为[M+H]+，[M+H-H2O]+，[M+Na]+，[M+K]+，[M+NH4]+。软件自动标识经处理后的可信数据并识别同一个化合物的不同加合形态，给出鉴定化合物的分子式、质量数误差、同位素匹配偏差，保留时间、峰强度及加合离子等信息，还可以根据高能量下的碎片信息自动匹配对应化合物结构可能的裂解方式。由于软件无法有效区分异构体类化合物，并且有时个别分子离子峰判断也可能存在误差，匹配鉴定的结果需要进行人工确认。此外，含量较高的未知成分，会显示在“No Match High”一栏中，需要人工解析。

利用UNIFI分析软件进行处理后自动匹配了500多个化合物，结合文献报道的化合物的质谱和色谱信息，并结合对照品，进一步核实鉴定化合物的合理性，最终鉴定出了68个化合物，包括3个黄酮类化合物，10个黄烷醇类化合物，34个木脂素类化合物，其中20个联苯环辛烯型木脂素类化合物，4个三萜类化合物，以及17个有机酸及其他类化合物，鉴定结果见表1。

321木脂素类化合物的鉴定木脂素类化学成分具有多种不同的结构类型[917]。通过本实验鉴定，彝药满山香中富含联苯环辛烯型木脂素类化合物，该类化合物在联苯环上有多个甲氧基取代，在八元环上有甲级、酯基等基团取代，质谱断裂的活性部位多发生在联苯C1，C14位置的甲氧基以及八元环上的取代基，其中，若联苯八元环上有羟基，则该羟基易失去，八元环C5C6键，C9C10键和C15C16键较易断裂[13]。以峰59为例，阐述该类化合物的质谱裂解途径：在低能量质谱图中出现准分子离子峰m/z 537212 0[M+H]+，以及加合离子峰m/z 559190 0[M+Na]+；在高能量下，m/z 519204 6，415176 3，397193 1分别是从 [M+H]+峰依次脱去失去1分子H2O，C7H4O和H2O所产生的碎片；m/z 373162 0是由m/z 415176 3离子失去碎片C3H6所产生的碎片离子，m/z 371184 2，383146 9分别是由m/z 415176 3离子失去碎片C2H4O和CH4O所产生的碎片离子； 331116 0是m/z 383146 9脱去C4H4所产生的碎片离子；m/z 341136 1，340128 6分别是m/z 397193 1离子失去碎片C2O2和C3H5O所产生的离子。根据质谱信息并和对照品比对，确定59为五味子酯甲，其裂解途径见图2。endprint

峰20在负离子模式下，低能量质谱中存在准分子离子m/z 555224 8[M-H]-和m/z 591201 5[M+Cl]- 的信号，在高能量质谱图中，m/z 447145 5是由[M-H]-失去联苯八元环上的碎片C2H4O2及C2位的CH4和C14位CH4O所产生的离子，m/z 359150 1离子是[M-H]-失去联苯八元环上C9C10键和C15C16键断裂失去C8H8O3碎片以及失去联苯八元环上C2H4O碎片所产生离子，m/z 329139 7离子是联苯八元环上C5C6键和C15C16键断裂失去m/z 195066 0（C11H16O3）以及失去联苯八元环上的HCOO碎片所产生离子，m/z 165055 0离子是[M-H]-联苯八元环上C5C6键断裂和C15C16键断裂所产生的碎片离子（C9H9O3-），与对照品质谱碎片信息一致，且和文献报道一致[1415]，确认峰20为内南五味子酯C。

在正离子模式下，峰46的低能量质谱中存在准分子离子峰m/z 419206 7[M+H]+ ，以及加合离子m/z 441187 7[M+Na]+和m/z 457162 8[M+K]+信号，在高能量质谱中，m/z 425215 6即是由[M+Na]+失去联苯八元环上的羟基所产生的，m/z 401196 6是[M+H]+失去1分子H2O所产生的离子，m/z 386173 8，370177 8是m/z 401196 6离子失去甲基和氧甲基所产生的，与对照品戈米辛H质谱信息一致，确认峰46为戈米辛H。峰33，41，45与46裂解信息类似，结合文献 [917]，确认峰33，41，45分别为表戈米辛O、戈米辛 L1、戈米辛S。

322萜类化合物的鉴定在负离子低能量

A低能量下；B高能量下。

图3满山香样品中南五味子酸质谱图

Fig3MS spectrum of kadsuric acid extracted from Schisandra propinqua in negative ion mode

质谱中，峰67存在准分子离子峰m/z 469332 4[M-H]-、加合离子峰m/z 515337 9[M+HCOO]-，在高能量质谱中，m/z 451321 4，425342 2，407332 2分别是[M-H]-失去1分子H2O，1分子CO2，1分子H2O和CO2的碎片离子，其质谱图见图3。和对照品的质谱和色谱信息比对，确证峰67为南五味子酸。峰66，68与南五味子酸有类似的裂解规律，结合文献报道[1819]确认为nigranoic acid和甘五酸，见表1。

323黄烷醇类化合物峰6的准分子离子峰为m/z 289070 9 [M-H]-，高能量下碎片峰m/z 261040 8，245080 8分别为[M-H]-丢失中性碎片CO，CO2所产生的碎片，m/z 271061 0为[M-H]-丢失H2O产生的碎片，与对照品儿茶素的色谱、质谱信息进行比对，确定为儿茶素。

峰27的准分子离子峰为m/z 577135 3 [M-H]-，高能量下出现m/z 451103 8，425087 5，407077 0，289071 5，161024 2等特征离子碎片，与对照品原花青素B2的保留时间及高能量下质谱碎片信息一致，确定峰27为原花青素B2。峰15，17，22的准分子离子峰均是m/z 577135 3 [M-H]-，碎片峰有m/z 45110，42509，40708，28907，16102，根据文献[2022]推测峰15，17，22为原花青素B族化合物的同分异构体，可能是原花青素B1、原花青素B3、原花青素B4、原花青素B5或原花青素B6，确切结构需进一步鉴定。

324黄酮苷类化合物在负离子模式下，黄酮苷类化合物易产生[M-H]-，[M-H-glu]-的离子。以峰25为例说明该类化合物的质谱裂解过程。在负离子模式下，低能量质谱图中出现m/z 609146 1 [M-H]-和645128 1[M+Cl]-的离子；高能量下产生苷元的特征碎片m/z 300029 2 的自由基离子，以及m/z 271017 5，255020 6，179104 6等特征离子碎片，通过与芦丁对照品的保留时间及质谱碎片信息比对，确定峰25为芦丁。

325有机酸类化合物本研究发现，满山香中富含脂肪酸类化合物，质谱图中一般出现[M-H]-，[M-H-CO2]-，[M-H-H2O]-等碎片离子。在负离子模式下，峰2的准分子离子峰为m/z 191019 9 [M-H]-，高能量下出现m/z 173045 1 [M-H-H2O]-，155952 5[M-H-2H2O]-，137024 6[M-H-3H2O]-，111008 3[M-H-CO2-2H2O]-，85029 3[M-H-H2O-2CO2]-的特征离子碎片，通过UNIFI分析并结合中药成分数据库，推断峰2为柠檬酸，其高能量下的质谱图及裂解途径见图4。

虚线表示断裂部位，红色部分表示脱失的部分。

峰3的准分子离子峰为m/z 133013 7 [M-H]-，高能量下出现m/z 115003 1 [M-H-H2O]-，87008 5 [M-H-H2O-CO]-的特征离子碎片离子；峰4的准分子离子峰为m/z 173044 8 [M-H]-，高能量下出现m/z 155034 4 [M-H-H2O]-，137024 0 [M-H-2H2O]-，111008 0 [M-H-2H2O-CO]-的特征离子碎片离子，通过UNIFI分析并结合中药成分数据库，推断峰3和峰4分别为2羟基丁二酸和莽草酸。

峰35的准分子离子峰为m/z 329233 0 [M-H]-，高能量下出現m/z 293210 1是[M-H-2H2O]-形成的碎片离子，m/z 139112 3是[M-H]-离子脱失COOH和C11C12键断裂后形成的碎片，m/z 127112 6 是[M-H]-离子脱失1分子H2O和C11C12键断裂形成的碎片离子，通过UNIFI分析并结合中药成分数据库，结合文献[22]报道，推断峰35为天师酸。峰28，37，38，54，56有类似的裂解规律。endprint

33未知化合物的鉴定

峰21在负离子模式下显示m/z 328104 2 [M-H]-，364078 2 [M+Cl]-和374110 3 [M+HCOO]-的离子；在正离子模式下显示m/z 347146 8 [M+NH4]+，352098 0[M+Na]+和368072 2 [M+K]+的峰，提示该化合物可能是一个生物碱，分子式为C14H19NO8或C21H15NO3。高能通道负离子模式下存在m/z 300025 6，197048 2碎片峰，可能分別是[M-H-CO]-，[C12H7NO2]-离子；正离子模式下存在m/z 303051 2，216977 9，207134 7等碎片离子。同时，紫外光谱中显示该化合物在194 nm有较强的紫外吸收，在217，273 nm有中等强度紫外吸收，推测该化合物有多个共轭双键，在Scifinder，ChemSpider等在线数据库中未检索到与之相匹配的结构，因此，推断该化合物为未知化合物，具体结构有待进一步研究确证，该化合物的紫外吸收光谱图及正、负离子模式下质谱图见图5。

4讨论

本研究通过利用UHPLCQTOF/MSE对彝药满山香药材的主要化学成分进行了表征，初步鉴定了包括黄酮、黄烷醇、木脂素、三萜和有机酸等质谱信号强度较高的68个主要成分的结构，发现1个分子式为C14H19NO8的未知化合物，原花青素B2、异形南五味子丁素、内南五味子酯 C、内南五味子素B、

a紫外吸收光谱图；b负离子高能量质谱图；c负离子低能量质谱图；d正离子高能量质谱图；e正离子低能量质谱图。

南五味子灵、nigranoic acid、南五味子酸等37个化合物为首次在彝药满山香中发现。文献报道黄酮、黄烷醇类化合物具有抗氧化、抗炎等作用，并能降低血压，保持血管弹性，减少血栓形成[2325]；木脂素类成分具有抗癌、抗肿瘤、抗肝炎病毒、抑制胆固醇生物合成、抗生育、抗脂质过氧化等活性[14，2728]，nigranoic acid具有抗HIV活性[29]。本实验结果提示彝药满山香富含芦丁、儿茶素、原花青素B族化合物等黄酮、黄烷醇类成分，以及联苯环辛烯型木脂素类成分和nigranoic acid、南五味子酸等三萜类化学成分。作为民族药材满山香具有较高开发和利用价值。本研究结果为彝药满山香药材的质量控制研究和临床药理研究以及资源开发利用提供了科学依据。

[致谢]样品采集过程得到了第四次全国中药资源普查队的帮助，满山香对照药材由昆明制药集团股份有限公司提供。

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[责任编辑孔晶晶]endprint