菠萝蛋白酶对干白葡萄酒蛋白质稳定性的影响

张梦园，董 烁，李 婧，李 辉，张军翔*

（1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学 葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；3.宁夏出入境检验检疫局综合技术中心，宁夏 银川 750021）

菠萝蛋白酶对干白葡萄酒蛋白质稳定性的影响

张梦园1，董 烁2，李 婧3，李 辉1，张军翔2*

（1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学 葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；3.宁夏出入境检验检疫局综合技术中心，宁夏 银川 750021）

研究菠萝蛋白酶对干白葡萄酒蛋白质稳定性的影响，以新鲜干白葡萄酒为试验材料，添加菠萝蛋白酶，通过测定葡萄酒的浊度、蛋白质稳定性、蛋白质含量，确定其最适添加量、作用温度和作用时间。结果表明，菠萝蛋白酶对两款酒样澄清的最佳添加量分别为2.0 mg/L、2.5 mg/L，温度均为22℃，作用时间为24 h。菠萝蛋白酶可澄清干白葡萄酒，明显提高其蛋白质稳定性。

蛋白质稳定性；菠萝蛋白酶；澄清

干白葡萄酒的蛋白质稳定性对酒的品质具有重要作用。幼年白葡萄酒装瓶后，在一定贮藏条件下，瓶中的蛋白质粒子或其反应物逐渐聚集，可能使葡萄酒变得浑浊不清，产生沉淀，严重影响葡萄酒的感官质量。因此，研究葡萄酒的蛋白质稳定性，避免白葡萄酒在贮藏过程中出现蛋白浑浊现象，具有重要的实际意义。葡萄酒的浑浊程度由浊度反映，浊度越大浑浊程度越高。葡萄酒的蛋白质稳定性由热检验前后葡萄酒的浊度差表示，与形成蛋白质浑浊的可能性成正比。一般认为，浊度差不超过2 NTU（浊度单位）即可判定该葡萄酒蛋白质稳定[1]。

近些年使用蛋白质水解酶代替皂土处理葡萄酒防止蛋白质破败，已经引起研究人员和酿酒师们的重视。蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的一种多肽大分子，可以找出一种或几种非专一酶切位点的酶对葡萄酒中的蛋白质进行酶切，将酒中的蛋白质分子切成小肽片段或氨基酸，这样在防止酒中蛋白质不稳定性的同时，既不显著影响葡萄酒的感官品质，又能增加酒中多肽和氨基酸的含量，提高酒的营养价值[2]。

从植物中提取的蛋白酶类由于具有一定的澄清效果，被逐渐应用于饮料、果酒、啤酒的澄清。郭玉蓉[3]研究表明，木瓜蛋白酶对梅鹿辄干红葡萄酒的澄清效果好，用量少、脱色轻；陈彦雄等[4]研究认为木瓜蛋白酶是较理想的赤霞珠葡萄酒澄清剂。张传军[5]研究发现，0.6%的木瓜蛋白酶在45℃反应38h后，可有效减少白葡萄酒中非稳定蛋白含量。柴丽娟等[6]向红葡萄酒中添加生姜蛋白酶，研究结果显示其对红葡萄酒的澄清效果显著。菠萝蛋白酶是存在于菠萝茎和果实中的一类蛋白水解酶，属于半胱氨酸蛋白酶，已经应用于白葡萄酒中预防酒体浑浊[7]。菠萝蛋白酶水解蛋白质的活性较木瓜蛋白酶高10倍以上，具有很强的分解蛋白质能力，并且具有酯键和酰胺键特性，已被广泛应用于化工、医药和食品行业[8]。徐凤彩等[9]用菠萝蛋白酶处理啤酒后，处理组比对照组啤酒的浑浊度下降了1.51～5.3倍，蛋白质含量下降了73%，而啤酒的口感、酒精含量、色度、总酸等指标无明显变化。BENUCCI I等[10]最新研究显示固定化菠萝蛋白酶在减少沉淀形成和总蛋白质含量的影响上，比固定化木瓜蛋白酶更显著，同时对葡萄酒的酚类物质，矿物成分及感官品质影响不明显。目前，国内关于菠萝蛋白酶澄清干白葡萄酒及其对干白葡萄酒中蛋白质稳定性影响的研究还鲜见报道。

为了更好地解决白葡萄酒贮藏过程中出现蛋白沉淀的现象，又同时保留酒的香气、风味，本试验利用菠萝蛋白酶水解贺兰山东麓霞多丽、贵人香干白葡萄酒中的不稳定蛋白，通过测定干白葡萄酒的浊度、蛋白质稳定性、葡萄酒中的蛋白质总量，研究菠萝蛋白酶的最佳用量和作用温度、作用时间，观察菠萝蛋白酶对干白葡萄酒的澄清效果，及其对干白葡萄酒中蛋白质稳定性的影响。以期为干白葡萄酒的澄清提供新的方法，为菠萝蛋白酶应用于提高干白葡萄酒的蛋白质稳定性的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

2016年10月未澄清的霞多丽干白葡萄酒（A）：宁夏类人首葡萄酒业有限公司；2016年10月未澄清的贵人香干白葡萄酒（B）：宁夏西夏王葡萄酒业有限公司。

1.1.2 试剂

菠萝蛋白酶（酶活600 U/mg）：成都艾科达化学试剂有限公司；考马斯亮蓝R-250、磷酸、乙醇（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；牛血清白蛋白溶液标准物质（2.0 mg/mL）：美国Pierce公司。

1.2 仪器与设备

2100Q浊度计：美国哈希公司；TU-1901紫外可分光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9070A恒温干燥箱：上海右一仪器有限公司；FA1004万分之一天平：上海上天精密仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 菠萝蛋白酶最适添加量、最适作用温度、作用时间的

确定

取40mL干白葡萄酒样于棕色玻璃密封瓶中，分别用菠萝蛋白酶在一定温度条件下作用一定时间后用0.45 μm滤膜进行过滤[11]。每个处理重复三次。分别考察不同菠萝蛋白酶添加量（0、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L、3.5mg/L）、不同作用温度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃）、不同作用时间（12 h、24 h、48 h、72 h、96h）对干白葡萄酒浊度、蛋白质总量和蛋白质稳定性的影响。

1.3.2 测定方法

标准曲线绘制：取6支试管分别配制0、10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的牛血清白蛋白溶液各2 mL，从各试管中分别取1 mL溶液于具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝R-250溶液混合均匀，待反应20 min后，在波长595 nm处测其吸光度值。以吸光度值（x）为横坐标，牛血清白蛋白含量（y）为纵坐标，绘制牛血清白蛋白标准曲线，得到牛血清白蛋白标准曲线回归方程为：y=246.37x-3.645 2，相关系数R2=0.994 2。

样品中蛋白质总量的测定：采用考马斯亮蓝R-250染色法[12]，取1 mL过滤后的酒样，加入5 mL考马斯亮蓝R-250溶液，以用1 mL蒸馏水作空白，待反应20 min后，在波长595 nm处测其吸光度值，根据牛血清白蛋白标准曲线计算酒样中蛋白质总量。

浊度：采用浊度仪测定[13]，以干白葡萄酒的浊度值表示酒样的澄清度，浊度值越小澄清度越好。

蛋白质稳定性：将菠萝蛋白酶水解且过滤的酒液用浊度仪测定其浊度值，以NTU（散射浊度单位）表示，记为α。将酒液放入80℃恒温水浴锅中加热6 h后，于4℃保持16 h，最后冷却至室温，再用浊度仪测定其测浊度，记为β[14]。计算加热处理前后的浊度差（浊度差=β-α），浊度差不超过2NTU则可判定葡萄酒蛋白质稳定，反之不稳定[15]。

2 结果与分析

2.1 菠萝蛋白酶添加量的确定

2.1.1 菠萝蛋白酶添加量对干白葡萄酒浊度及蛋白质稳定

性的影响

考察菠萝蛋白酶添加量对干白葡萄酒浊度和蛋白质稳定性的影响，结果见图1。

图1 菠萝蛋白酶添加量对葡萄酒浊度（a）和蛋白质稳定性（b）的影响Fig.1 Effect of bromelain addition on wine turbidity(a)and protein stability(b)

由图1可知，随着菠萝蛋白酶添加量的增加，葡萄酒的浊度和澄清度均呈先降低后增加的趋势，其中A款葡萄酒在添加2.0 mg/L的菠萝蛋白酶时浊度最小（1.73 NTU），澄清度良好，热处理浊度差最小（1.43 NTU），表明蛋白质稳定性良好；随后菠萝蛋白酶添加量增加，葡萄酒的浊度上升，浊度差变大；B款葡萄酒在菠萝蛋白酶添加量2.5 mg/L时浊度达到最小，蛋白质最稳定。添加菠萝蛋白酶对葡萄酒中不稳定蛋白质进行水解，可提高葡萄酒的澄清度和蛋白质稳定性，但当葡萄酒中的菠萝蛋白酶超过最适添加量之后，由于其本身属于一种蛋白质，过多的菠萝蛋白酶反而不利于葡萄酒的蛋白质稳定性。因此，A款和B款葡萄酒的菠萝蛋白酶最适添加量分别为2.0 mg/L和2.5 mg/L。

2.1.2 菠萝蛋白酶添加量对干白葡萄酒中蛋白质总量的影响

考察菠萝蛋白酶添加量对干白葡萄酒中蛋白质总量的影响，结果见图2。

图2 菠萝蛋白酶添加量对干白葡萄酒中蛋白质总量的影响Fig.2 Effect of bromelain addition on total protein content in dry white wine

由图2可知，随着菠萝蛋白酶用量的增加，两款葡萄酒中的蛋白质总量均呈先降低后增加的趋势，其中A款葡萄酒添加2.0 mg/L菠萝蛋白酶时，蛋白质总量下降到最小（15.04 mg/L）；B款葡萄酒添加2.5 mg/L菠萝蛋白酶时，蛋白质总量最小（14.30 mg/L）。继续增加菠萝蛋白酶添加量，两款葡萄酒的蛋白质总量均开始上升，这与乔园园[17]的研究结果相似，高酶浓度处理过的酒样会受蛋白酶的影响，蛋白质含量增多，不利于葡萄酒优良品质的形成。结果表明，A款和B款葡萄酒的菠萝蛋白酶最适添加量分别为2.0mg/L和2.5 mg/L。

2.2 菠萝蛋白酶作用温度的确定

考察菠萝蛋白酶作用温度对干白葡萄酒蛋白质稳定性的影响，结果见图3。

由图3可知，随着作用温度的升高，两款酒样的浊度差均先下降后趋于平缓。经菠萝蛋白酶作用后两款葡萄酒热处理后浊度差均＜2 NTU，表明蛋白质稳定性较好；当作用温度为22℃时，A、B两款葡萄酒的浊度差最小，分别为1.54 NTU和1.18 NTU，此时葡萄酒的蛋白质稳定性最好。温度对植物蛋白酶的活性影响很大，BENUCCI I等[16]研究结果表明，菠萝蛋白酶在10～60℃均有活性，但因生产中温度过高会影响葡萄酒的香气和品质，也会增加蛋白质浑浊产生的风险。由图3可知，选择22℃为菠萝蛋白酶的最适作用温度。

图3 菠萝蛋白酶的作用温度对蛋白质稳定性的影响Fig.3 Effect of bromelain action temperature on protein stability

考察菠萝蛋白酶作用温度对干白葡萄酒蛋白质总量的影响，结果见图4。

图4 菠萝蛋白酶作用温度对葡萄酒中蛋白质总量的影响Fig.4 Effect of bromelain action temperature on total protein content

由图4可知，随着作用温度在18～26℃范围内增加，A、B两款酒的蛋白质总量先降低后趋于平缓。当作用温度为22℃时，蛋白质总量最低，菠萝蛋白酶的作用效果最好，水解酒样中的蛋白质最多，生产中温度过高会增加葡萄酒产生浑浊的风险，也会损耗酒的香气，所以参考实际试验，选择22℃为菠萝蛋白酶的最适作用温度。

2.3 菠萝蛋白酶作用时间的确定

考察菠萝蛋白酶作用时间对干白葡萄酒蛋白质稳定性的影响，结果见图5。

由图5可知，随着菠萝蛋白酶作用时间的延长，葡萄酒的浊度差先下降后趋于平缓。当作用时间为12 h时，A、B两款酒的浊度差均＞2 NTU，蛋白质不稳定，当作用时间≥24 h，葡萄酒的浊度差均＜2 NTU，且随着时间的延长变化不明显，表明蛋白质稳定性良好，因此24 h可作为菠萝蛋白酶的最佳作用时间。

图5 菠萝蛋白酶作用时间对蛋白质稳定性的影响Fig.5 Effect of bromelain action time on protein stability

考察菠萝蛋白酶作用时间对干白葡萄酒蛋白质总量的影响，结果见图6。

图6 菠萝蛋白酶的作用时间对葡萄酒蛋白质总量的影响Fig.6 Effect of bromelain action time on total protein content

由图6可知，随着菠萝蛋白酶作用时间的延长，葡萄酒的蛋白质总量先下降后趋于平缓。A、B两款葡萄酒经菠萝蛋白酶作用12 h，酒样中的蛋白质总量最高，为19.02 mg/L；当作用时间为24h，酒样中的蛋白质总量减小，为12.12mg/L；继续延长作用时间，A、B两款葡萄酒中蛋白质总量没有明显变化，趋于稳定。在酒样相同（即底物浓度一定）且菠萝蛋白酶添加量一定，作用温度相同的情况下，蛋白酶保持活性将酒中的不稳定蛋白水解为小肽片段、氨基酸；水解酶作用结束，失去活性，酒样中蛋白质总量减小且随时间变化不再明显变化。从经济效益及操作效率方面考虑，菠萝蛋白酶对白葡萄酒中的蛋白质水解的最佳作用时间为24 h。

3 结论

本试验采用菠萝蛋白酶澄清干白葡萄酒，研究了其对白葡萄酒浊度及蛋白质总量的影响。结果表明，A、B两款葡萄酒的菠萝蛋白酶最适添加量分别为2.0 mg/L和2.5 mg/L，22℃作用24 h时，菠萝蛋白酶对干白葡萄酒的澄清效果较好，且蛋白质稳定性良好。目前，葡萄酒厂为提高干白葡萄酒的澄清度和蛋白质稳定性，主要选择皂土作为澄清剂，而皂土所存在的诸多弊端使寻找新的可替代澄清材料成为白葡萄酒生产的迫切需求，经试验发现菠萝蛋白酶可澄清干白葡萄酒，提高其蛋白质稳定性，有望在今后应用于广泛的生产中，具有一定实际意义。

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Effect of bromelain on protein stability of dry white wine

ZHANG Mengyuan1,DONG Shuo2,LI Jing3,LI Hui1,ZHANG Junxiang2*
(1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2.Wine School,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;3.Technology Center of Ningxia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Yinchuan 750021,China)

The effect of bromelain on protein stability of dry white wine was researched.Using the fresh dry white wine as experimental material,with addition of bromelain,the optimum bromelain addition,action temperature and time were determined by the determination of wine turbidity,protein stability and protein content.The results showed that the optimum bromelain addition to clarify two wine samples were 2.0 mg/L and 2.5 mg/L,respectively.The action temperature and time were 22℃and 24 h,respectively.The bromelain could clarify dry white wine and improve protein stability significantly.

protein stability;bromelain;clarification

TS262.6

0254-5071（2017）10-0052-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.012

2017-05-23

宁夏重点研发计划重大项目（2016BZ06）

张梦园（1992-），女，硕士研究生，研究方向为葡萄酒的稳定性。

*通讯作者：张军翔（1971-），男，教授，博士，研究方向为葡萄与葡萄酒酿造。