苯乳酸与食品防腐剂联合抑菌效果

宁亚维 - 闫爱红 - 王世杰 - 王志新 - 李兴峰 - 朱 宏 贾英民 -

(1. 河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2. 石家庄君乐宝乳业有限公司，河北 石家庄 050221；3. 北京工商大学食品学院，北京 102488) (1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2. Shijiazhuang Junlebao Dairy Co., Ltd., Shijiazhuang, Hebei 050221, China; 3. Beijing Technology and Business University, School of Food and Chemical Engineering, Beijing 102488, China)

苯乳酸与食品防腐剂联合抑菌效果

宁亚维1NINGYa-wei1闫爱红1YANAi-hong1王世杰2WANGShi-jie2王志新1WANGZhi-xin1李兴峰1LIXing-feng1朱 宏2ZHUHong2贾英民3JIAYing-min3

(1. 河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2. 石家庄君乐宝乳业有限公司，河北 石家庄 050221；3. 北京工商大学食品学院，北京 102488) (1.CollegeofBioscienceandBioengineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 2.ShijiazhuangJunlebaoDairyCo.,Ltd.,Shijiazhuang,Hebei050221,China; 3.BeijingTechnologyandBusinessUniversity,SchoolofFoodandChemicalEngineering,Beijing102488,China)

以食源性病原菌Escherichiacoli和Listeriamonocytogenes为指示菌，研究了苯乳酸与常用食品防腐剂的联合抑菌作用。采用微量二倍稀释法和棋盘法分别测定苯乳酸与6种防腐剂的最小抑菌浓度及联合抑菌指数，并通过时间—杀菌曲线进一步考察复配较优组合的协同抑菌效果。结果显示：苯乳酸与乳酸链球菌素联用对E.coli和L.monocytogenes分别表现为无关和相加作用；苯乳酸与对羟基苯甲酸乙酯联用对2株指示菌均为相加作用；与EDTA-Na2和ε-聚赖氨酸联用对2株指示菌均为无关作用；苯乳酸分别与苯甲酸钠和山梨酸钾联用对E.coli均表现为协同作用，对L.monocytogenes均表现为相加作用。苯乳酸分别与苯甲酸钠和山梨酸钾联合使用后，苯乳酸使用剂量降低75%，苯甲酸钠和山梨酸钾的使用剂量均可以降低50%。

苯乳酸；食品防腐剂；协同抑菌

苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)是近年来发现的一种新型天然抑菌物质，存在于蜂蜜[1]、酸面团[2]、泡菜[3]等食品中，可由乳酸菌代谢产生[2,4]。苯乳酸具有广谱抑菌性，不仅能够抑制革兰氏阳性菌(如Staphylococcusaureus、Listeriamonocytogenes)和革兰氏阴性菌[5-6](如Escherichiacoli、Salmoellaenterica、Providenciaatuartii、Klebsiellaoxytoca)，而且能够有效抑制多种真菌[7](如Colletotrichumgloeosporioides、Aspergillusflavus、Penicilliumexpansum、Botrytiscinerea等)。此外，苯乳酸具有溶解性好、易于在食品体系中扩散、酸与热稳定性高[5]等优点。然而苯乳酸的抑菌效力较低，如对细菌的最小抑菌浓度为1.25～5.00 mg/mL，对真菌的最小抑菌浓度为5～10 mg/mL[8]，较Nisin、ε-聚赖氨酸等生物防腐剂对应的最小抑菌浓度高数十倍。因此苯乳酸作为生物防腐剂使用价格相对较高，限制了其商业化应用。

“栅栏技术”在食品防腐剂的应用，通常是通过使用少量、多种防腐剂以达到良好防腐效果。多项研究表明防腐剂之间存在协同抑菌效应。如Liu等[9]研究了ε-聚赖氨酸与Nisin的联合抑菌作用，结果表明二者联合作用于E.coli、B.subtillis和S.aureus均表现出协同抑菌作用；Manalhães等[10]研究了鼠李糖脂与Nisin对L.monocytogenes的协同作用，研究结果显示鼠李糖脂与Nisin联用可分别降低2种抑菌剂的使用浓度；高玉荣等[11]研究了纳他霉素与山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸、硝酸钠和脱氢乙酸钠5种化学防腐剂的联合抑菌效果，发现纳他霉素与除苯甲酸钠之外的4种防腐剂之间存在协同抑菌作用；莫树平等[12]研究了ε-聚赖氨酸与乳酸链球菌素和那他霉素三者复配对食品中常见的腐败菌与致病菌的抑制效果，结果表明生物防腐剂的联合使用可显著增强ε-聚赖氨酸的抑菌效果。因此，通过多种防腐剂的联用可以减少单一防腐剂的添加量，降低成本，提高食品安全性。

本研究拟以常见食源性病原菌大肠杆菌(E.coliATCC 44752)和单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes10403s)为指示菌，考察了苯乳酸与常用食品防腐剂山梨酸钾、苯甲酸钠等的联合抑菌效果，以期为苯乳酸与防腐剂在食品防腐中的联合使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

E.coliATCC 44752和L.monocytogenes10403s：河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏。

1.2 试剂与培养基

苯乳酸：纯度98%，美国Sigma公司；

苯甲酸钠：纯度99.9%，西陇化工股份有限公司；

山梨酸钾：纯度99.9%，国药集团化学试剂有限公司；

EDTA-Na2：纯度99%，天津博迪化工股份有限公司；

对羟基苯甲酸乙酯：纯度99%，国药集团化学试剂有限公司；

Nisin：≥900 IU/mg，上海麦克林生化科技有限公司；

ε-聚赖氨酸：生物试剂，美国AMRESCO公司；

TSB：生物试剂，北京索莱宝科技有限公司；

NB：生物试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司。

1.3 仪器与设备

紫外分光光度计：Evolution 220型，美国Thermo公司；

酶标仪：SpectraMax Plus 384型，美国Molecular Devices公司；

恒温摇床：ZHWY型，上海智城分析仪器制造公司；

恒温培养箱：ZSD-A1160型，上海智城分析仪器制造公司；

超净台：ZHJH-C110913型，上海智城分析仪器制造公司。

1.4 方法

1.4.1 最小抑菌浓度 参照Wiegand等[13]的方法采用二倍稀释法测定苯乳酸及6种食品防腐剂的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。向无菌96孔板的前11列中加入灭菌培养基，食品防腐剂从第1～10列依次进行二倍梯度稀释；第11列不加入食品防腐剂，作为阳性对照；第12列只加入培养基，作为阴性对照；最后每孔加入等体积的指示菌，终浓度约为5×105CFU/mL，37 ℃培养24 h，用SpectraMax Plus 384酶标仪进行测定。

1.4.2 联合抑菌作用 根据各防腐剂的MIC值，参考Segal等[14]的方法略作修改进行联合抑菌活性测定。用微量移液器沿无菌96孔微孔板的X轴方向(从左到右)在第2～8列每列孔中依次加入8倍 MIC至1/8 MIC的苯乳酸(A)；同样，沿Y轴方向(从上到下)在第B～F行每行孔中加入8倍MIC至1/8 MIC的食品防腐剂(B)；最终得到A(2倍MIC至1/32 MIC)× B(1/32 MIC至2倍MIC)49种联用组合，第1列和第A行分别为单独加入A/B的对照组；然后加入1.0×106CFU/mL的菌悬液，37 ℃培养24 h后，用酶标仪进行测定。

通过计算部分抑菌浓度指数(Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI)判断协同作用效果，计算方法为：

FICI=FICA+FICB=MICA联用/MICA单独+MICB联用/MICB单独，

(1)

式中：

FICI——苯乳酸与食品防腐剂联用时的部分抑菌浓度指数；

FICA——苯乳酸和食品防腐剂联合使用时苯乳酸的部分抑菌浓度指数；

FICB——苯乳酸和食品防腐剂联合使用时食品防腐剂的部分抑菌浓度指数；

MICA联用——苯乳酸和食品防腐剂联合使用时苯乳酸的MIC，mg/mL；

MICA单独——苯乳酸单独使用时的MIC，mg/mL；

MICB联用——苯乳酸和食品防腐剂联合使用时食品防腐剂的MIC，mg/mL；

MICB单独——食品防腐剂单独使用时的MIC，mg/mL。

当FICI≤0.5时，为协同作用；当0.52时，为拮抗作用。

1.4.3 时间—杀菌曲线 以棋盘法试验结果作为参考，进一步考察了苯乳酸与苯甲酸钠和山梨酸钾较优组合下的联合抑菌效果。将菌悬液浓度调至1.0×106CFU/mL分别加入含有苯乳酸、苯甲酸钠、山梨酸钾以及苯乳酸和苯甲酸钠、山梨酸钾两两混合培养液的试管中，使菌悬液终浓度为5×105CFU/mL。将上述含有防腐剂的菌悬液于37 ℃恒温培养箱中培养，分别于0，2，4，6，9，12，24 h取样，并采用平板计数法测定活菌数。以时间为横坐标，lg CFU/mL为纵坐标绘制时间—杀菌曲线。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度

分别测定了苯乳酸和6种常见食品防腐剂对E.coli和L.monocytogenes的最小抑菌浓度。结果表明，苯乳酸对E.coli的MIC值为1.25 mg/mL，对L.monocytogenes的MIC值为2.25 mg/mL，与袁景环等[8]的研究结果一致；ε-聚赖氨酸对2株指示菌的抑菌效果强于苯乳酸等其余6种防腐剂，其对E.coli和L.monocytogenes的MIC值分别为0.156 0，0.007 8 mg/mL，ε-聚赖氨酸对L.monocytogenes的MIC值显著低于对E.coli的，与Geornaras等[15]的研究结果一致；其次是Nisin，但其只能够抑制革兰氏菌L.monocytogenes，其MIC值为0.25 mg/mL，而对革兰氏阴性菌E.coli无抑菌作用；EDTA-Na2对2株指示菌的MIC值相同均为0.625 mg/mL；对羟基苯甲酸乙酯对E.coli和L.monocytogenes的MIC值分别为0.625，1.000 mg/mL；山梨酸钾对E.coli和L.monocytogenes的MIC值分别为12.5，28.0 mg/mL；苯甲酸钠对E.coli和L.monocytogenes的MIC值分别为10.5，25.0 mg/mL。上述结果表明，各防腐剂间抑菌效应差异显著，ε-聚赖氨酸和EDTA-Na2对2株指示菌抑制效果均较好；而食品中常用的化学防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾对细菌的抑制效果则较差。防腐剂的抑菌效果差异同其抑菌作用机制相关，而不同作用机制的防腐剂间联合使用，更易于发挥协同增效抑菌作用。因此，有必要考察苯乳酸与上述防腐剂的联合使用效应，以筛选能同苯乳酸发挥协同抑菌作用的防腐剂。

2.2 联合抑菌作用

通过微量棋盘法考察了苯乳酸与食品防腐剂的联合抑菌效应，结果见表1。对于L.monocytogenes本研究所选防腐剂均不能与苯乳酸联用发挥协同抑菌作用，对于E.coli苯乳酸分别与苯甲酸钠和山梨酸钾联用具有协同抑菌作用。山梨酸钾和苯甲酸钠主要用于抑制霉菌和酵母菌，对细菌抑制作用相对较弱。而苯乳酸与苯甲酸钠联用后，苯乳酸的浓度降为单独使用时的1/2～1/4，苯甲酸钠的浓度则降为单独使用时的1/2～1/16，苯甲酸钠的使用量由单独使用时的10.50 mg/mL 降为0.65 mg/mL，使其使用量低于食品添加剂使用标准最大使用量1 g/kg(GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》)，可作为抑制细菌的防腐剂用于食品加工中。因此，苯乳酸与苯甲酸钠联用可以扩大苯甲酸钠的抑菌谱，降低两者的使用剂量。同样，山梨酸钾与苯乳酸联用后，苯乳酸使用量降为单独使用时的1/2～1/4，山梨酸钾使用量降为单独使用时的1/2～1/8。上述结果表明苯乳酸分别与山梨酸钾和苯甲酸钠联用后，生物防腐剂苯乳酸和化学防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾使用剂量均显著降低，因此若将其作为复合食品防腐剂可显著降低使用成本，提高使用安全性。

表1 苯乳酸与食品防腐剂联合抑菌活性Table 1 Determination of the antibacterial activity of PLA in combination with preservatives

2.3 时间—杀菌曲线

通过时间—杀菌曲线对棋盘法选出的复配较优组合的联合抑菌效果进行考察。由图1可知，1/4 MIC浓度苯乳酸对E.coli没有抑菌作用，1/2 MIC浓度苯甲酸钠作用E.coli24 h后，与对照组相比活菌数降低了1.69个对数值，然而二者联合作用6 h后，菌落数降低了3.41个对数值，表现出显著抑菌作用；作用9 h后，联用组与MIC浓度苯甲酸钠对E.coli抑菌趋势基本相同，表明苯乳酸与苯甲酸钠具有显著协同抑菌作用。

由图2可知，1/4 MIC浓度苯乳酸和1/2 MIC浓度山梨酸钾分别作用于E.coli均不能抑制其生长。然而1/4 MIC浓度苯乳酸与1/2 MIC浓度山梨酸钾联合作用6 h后，活菌数降低了3.63个对数值；联合作用24 h后，菌落总数较初始值没有显著增加，表明苯乳酸与山梨酸钾联用可以有效抑制E.coli的生长繁殖。

苯乳酸可增加环境中氢离子的浓度，山梨酸钾和苯甲酸钠的抑菌活性会随介质pH降低而增加，因此苯乳酸可以增强苯甲酸钠和山梨酸钾的抑菌作用效果；此外，苯甲酸钠的作用机理是抑制微生物细胞呼吸酶系的活性，尤其能够阻碍乙酰辅酶A缩合反应，从而起到抑菌作用；山梨酸钾的抑菌机制在于它能与微生物细胞中酶的巯基形成共价键，使酶丧失活性，破坏许多重要酶系[16]；苯甲酸钠和山梨酸钾顺利进入微生物细胞是发挥抑菌作用的前提，苯乳酸能够破坏细菌的屏障结构——细胞壁[5]，从而有利于苯甲酸钠和山梨酸钾进入细胞内发挥抑菌作用。因此，苯乳酸与山梨酸钾和苯甲酸钠联合使用具有协同抑菌作用。

图1 苯乳酸与苯甲酸钠联用对E. coli的时间—杀菌曲线

Figure 1 Time-kill curve of PLA in combination with sodium benzoate againstE.coli

图2 苯乳酸与山梨酸钾联用对E. coli的时间—杀菌曲线

Figure 2 Time-kill curve of PLA in combination with potassium sorbate againstE.coli

3 结论

本试验研究了苯乳酸与常用食品防腐剂的联合抑菌效果，其中苯乳酸与所选用的6种防腐剂联用对L.monocytogenens均不产生协同抑菌作用，而苯乳酸与2种化学防腐剂——苯甲酸钠和山梨酸钾联用对E.coli具有协同增效作用，FICI分别为0.312，0.375；联用后，苯乳酸使用剂量降低75%，苯甲酸钠和山梨酸钾均降低50%。本研究筛选了能与苯乳酸联合使用发挥协同抑菌作用的食品防腐剂，可为苯乳酸在食品防腐中的应用研究提供理论依据；下一步工作将考察苯乳酸与常用食品防腐剂联用对食品基质的保鲜防腐效应。

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Studyonantibacterialactivityofphenyllacticacidcombined
withfoodpreservatives

The antibacterial activity of phenyllactic acid (PLA) combined with food preservatives against foodborne pathogensEscherichiacoliandListeriamonocytogeneswas studied. The minimal inhibitory concentrations were determined by broth micro-dilution method and the interaction of PLA with food preservatives was determined using the checkerboard test. Furthermore, the synergistic effect of the optimized combination was evaluated through the time-kill assay. Results showed that PLA combined with nisin showed indifference effect againstE.coliand additive effect againstL.monocytogenes. The interaction of PLA and ethylp-hydroxybenzoate showed an additive effect againstE.coliandL.monocytogenes. PLA combined with EDTA-Na2orε-poly-L-lysine was observed indifference againstE.coliandL.monocytogenes. PLA combined with sodium benzoate or potassium sorbate exhibited synergistic effect againstE.coli, and additive effect againstL.monocytogenes. The dosage of PLA was decreased 75%, and that of sodium benzoate or potassium sorbate reduced 50%, when PLA combined with sodium benzoate or potassium sorbate againstE.coli.

phenyllactic acid; food preservatives; synergistic antibacterial effect

河北省杰出青年基金(编号：C2016208142)；河北省自然科学基金(编号：C2016208150)；国家自然科学基金(编号：31401653)

宁亚维，女，河北科技大学副教授，博士。

贾英民(1961—)，男，北京工商大学教授，博士。

E-mail: jiayingmin@btbu.edu.cn

2017—03—23

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.025