分光光度法检测饲料添加剂β-胡萝卜素粉含量的研究

虞哲高,赵小阳

(1.帝斯曼营养产品部中国研发中心,帝斯曼中国有限公司,上海 201203;2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,国家饲料质量监督检验中心(北京),北京 100081)

分光光度法检测饲料添加剂β-胡萝卜素粉含量的研究

虞哲高1,赵小阳2*

(1.帝斯曼营养产品部中国研发中心,帝斯曼中国有限公司,上海 201203;2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,国家饲料质量监督检验中心(北京),北京 100081)

依据β-胡萝卜素异构体的等吸收波长的特性,建立了用分光光度法测定饲料添加剂β-胡萝卜素粉的测定方法.试样经酶解后,用乙醇和二氯甲烷提取,用环己烷稀释后,在421.0 nm处测定.该方法的检测结果与AOAC 2005.7液相色谱法测定的结果吻合;该方法在0.6~6 μg/mL浓度范围内有良好的线性,线性回归系数R2=0.999 8;样品测试的相对标准偏差为2.52%.该方法具有快速、准确、分析成本低等优点.

分光光度法;等吸收波长;β-胡萝卜素;饲料添加剂

β-胡萝卜素是维生素A的前体,广泛存在于绿色和黄色蔬菜、水果中,其分子结构相当于2个分子的维生素A,当动物机体需要维生素A时,可及时转化为维生素A,当体内维生素A的量足够满足体内代谢需要时,β-胡萝卜素会在体内储存起来,发挥其作用.除了具备维生素A的作用外,β-胡萝卜素还能消除动物体内有毒的氧自由基,提高动物自身免疫力,促进动物生长,提高生产性能,特别对母畜禽繁殖性能有明显效果.此外,β-胡萝卜素呈黄色至红色,也是一种有效的着色剂.工业上,β-胡萝卜素可通过化学合成和微生物发酵法制备.

饲料添加剂β-胡萝卜素粉是以β-胡萝卜素结晶为原料,并添加淀粉、明胶等辅料经喷雾干燥制成的桔红色至红褐色微粒.在高温条件下,部分反式β-胡萝卜素会转变为顺式β-胡萝卜素[1],在β-胡萝卜素粉产品中,会有部分顺式β-胡萝卜素在生产过程中产生.对于全反式的β-胡萝卜素结晶,欧洲药典(EP 9.2)、美国药典(USP 2017)、英国药典(BP 2017)均采用分光光度法、依据在环己烷溶液中全反式β-胡萝卜素最大吸收波长处的百分吸光系数为2 500的特性,测定455 nm处最大吸光度来计算含量.由于反式β-胡萝卜素和顺式β-胡萝卜素在455 nm处的百分吸光系数不同[2],测定全反式β-胡萝卜素结晶的方法不能准确地测定饲料添加剂β-胡萝卜素粉的含量.AOAC 2005.7是用反相高效液相色谱法测定β-胡萝卜素总量的方法,适用于饲料添加剂β-胡萝卜素粉的测定.该方法具有专属性高、准确度好等优点,但分析成本较高.

有研究表明[3],在环己烷溶剂中,β-胡萝卜素顺反式异构体在421.0 nm波长处具有相同的百分吸光系数.依据这一研究成果,本研究在421.0 nm的等吸收波长处用分光光度法检测饲料添加剂β-胡萝卜素粉含量,旨在建立适用于检测饲料添加剂β-胡萝卜素粉的分光光度分析方法.

1 试验方法

1.1 试剂和溶液 无水乙醇、二氯甲烷、环己烷、2,6-二叔丁基对甲酚、碱性蛋白酶.

1.2 仪器设备 分析天平:感量为0.000 1g;超声波振荡提取器;离心机:4 000 r/min;紫外可见分光光度计;氧化钬玻璃滤光片.

1.3 含量测定

1.3.1 原理 酶解法破膜后,用无水乙醇和二氯甲烷提取β-胡萝卜素,用环己烷将β-胡萝卜素稀释至适当浓度.试样中的顺反异构体在421.0 nm处有相同的百分吸光系数,在该等吸收波长处,用分光光度仪测定试样溶液的吸光度,通过吸光度计算β-胡萝卜素总量.

1.3.2 试液的制备 称取的试样约100 mg,精确至0.1 mg,置于250 mL棕色容量瓶中.再在容量瓶内加入100 mg 2,6-二叔丁基对甲酚、200 mg碱性蛋白酶、10 mL蒸馏水,于50℃水浴中超声30 min.加入100 mL无水乙醇、135 mL二氯甲烷,摇匀后继续超声处理5 min.待冷却后用二氯甲烷稀释至刻度,摇匀后取适量,以3 000 r/min转速离心5 min.准确吸取上清液10 mL,置于100 mL棕色容量瓶中,加入5 mL无水乙醇,用环己烷溶解并稀释至刻度,摇匀后即为待测溶液.

1.3.3 测定 紫外可见分光光度仪的波长精度要求准确.在测定前,用氧化钬玻璃滤光片对仪器的波长精度做校正,测定样品的工作波长λw,λw根据公式λw=421.0+λf‐λt得出.氧化钬在 360.9 nm 处有一吸收峰,式中λf为在紫外可见分光光度仪上测得氧化钬滤光片在该吸收峰的波长值,λt为经计量校正得到的氧化钬滤光片在该吸收峰的波长值.

以环己烷为空白,用1 cm宽的比色皿测定待测溶液在工作波长λw的吸光值.

1.3.4 β-胡萝卜素含量计算 计算公式:

式中, X1为β-胡萝卜素含量,以质量分数表示(%);A为试液的吸收值;W为试样质量(g);2 500为试液稀释体积(mL);1 480为β-胡萝卜素在工作波长λw处的百分吸光系数.

1.3.5 方法的检测限 用该法测定β-胡萝卜素粉的最低检测限为β-胡萝卜素的含量为1%.

1.4 方法学验证

1.4.1 验证参数及验收标准 以收集的饲料添加剂β-胡萝卜素为试样,进行方法学验证.分析方法验证所涉及的参数及其验收标准见表1.

表1 验证参数及验收标准

1.4.2 线性范围 在环己烷中,用全反式β-胡萝卜素标准品配制浓度为0.6~6 μg/mL的标准系列溶液,浓度及其对应于421.0 nm处吸光度关系曲线见图1.结果显示,在此浓度范围内,浓度与吸光度值之间具有良好的线性范围,线性回归系数R2大于0.999.

图1 线性范围的测试

1.4.3 重现性 按照"1.3.2、1.3.3"规定的步骤,对同一批饲料添加剂β-胡萝卜素粉测试6次,含量在10.02%~10.72%,相对标准偏差RSD%为2.52%,表明方法具有良好的重现性.

1.4.4 准确度 用分光光度法方法(UV法)和AOAC 2005.7方法(HPLC法)分别测试了6家企业生产的饲料添加剂β-胡萝卜素粉样品.2种方法测得结果的相对偏差在5%以内(表2).配对样本t检验的统计显示,2种方法的结果无显著性差异.

表2 UV法和HPLC法测试结果的比较 %

1.4.5 稳定性 考察样品溶液酶解提取后β-胡萝卜素在环己烷中的稳定性.提取液经环己烷稀释后,立即按分光光度法测定等吸收波长421.0 nm处的吸光度,吸光度值以A0表示,以后每隔10 min测1次吸光度值.从表3可看出,样品用环己烷稀释后,在1 h内,样品的吸光度稳定.

表3 β-胡萝卜素样品溶液的稳定性测试

1.4.6 验证小结 用分光光度法测定饲料添加剂β-胡萝卜素粉含量的验证结果表明,所有验证参数均能满足验收标准的要求,建立的分光光度法适用于饲料添加剂β-胡萝卜素粉含量的测定.

2 结 果

AOAC 2005.7液相色谱法的检测结果显示,6家不同企业的β-胡萝卜素粉产品中,均发现有部分顺式异构体存在.图2是用液相色谱法测得的饲料添加剂β-胡萝卜素粉的色谱图.由于不同企业的生产工艺不同,产品中顺反式异构体的比例有所差异.顺式异构体是在喷雾干燥过程中由于温度的影响而产生的.

图2 全返式β-胡萝卜素标准溶液色谱图

β-胡萝卜素异构体的百分吸光系数在最大吸收波长处存在差异.表4为在正己烷溶剂中,β-胡萝卜素异构体在最大吸收波长处的百分吸光系数值[2].饲料添加剂β-胡萝卜素粉有顺反式结构的异构体,且顺反异构体的比例没有一个固定值,在β-胡萝卜素最大吸收波长处测定吸光值,无法得出准确的结果.

表4 β-胡萝卜素的百分吸光系数

对于文献[3]报道的421.0 nm处的等吸收点波长,通过下述实验予以确认.称取约6 mg的全反式β-胡萝卜素标准品和0.5 g 2,6-二叔丁基对甲酚于100 mL容量瓶中,用四氢呋喃溶解并定容至刻度.精密吸取3.0 mL全反式β-胡萝卜素溶液于有螺帽的小试管中,用高效液相色谱法和分光光度法考察不同温度条件下溶液的情况.液相色谱的结果显示,全反式β-胡萝卜素溶液在密封的小试管内于100℃条件下加热2 h,β-胡萝卜素的总量未发现有明显下降.但溶液在加热过程中,顺反比例发生了变化.加热时间越长,产生的顺式异构体的比例越高.将不同温度条件下β-胡萝卜素溶液在分光光度仪上于350~550 nm波长范围内扫描,光谱图见图3.由图3可知,4个含量相同、顺反式比例不同的β-胡萝卜素溶液,在最大吸收波长处的吸收度是不同的,加热的时间越长,即产生顺式异构体比例越高的溶液,在最大吸收波长处的吸光度越低.

图3 β-胡萝卜素在300~550 nm的光谱图

图4 β-胡萝卜素在400~430 nm光谱图

图4为截取图3的部分波长范围的光谱图.由图4可以看出,尽管4个溶液的顺反式β-胡萝卜素的比例有差异,但在421.0 nm处吸光度几乎相同.421.0 nm处的等吸收点波长处,顺反式β-胡萝卜素有相同的百分吸光系数,在该波长处,β-胡萝卜素的顺反式比例的多少不影响吸光度值,在该点测定能保证结果的准确性.由于等吸收点波长处位于峰肩,分光光度仪波长的偏移会影响到测试结果的准确度,要求在测定前,用氧化钬滤光片对仪器的波长精度作校正.

3 结 论

本文建立了在β-胡萝卜素的等吸收波长处测定吸光度的分光光度分析方法.该方法测定结果与AOAC2005.7用HPLC测定的结果一致.本方法具有分析成本低、简便快速、准确度高的特点,有较高的应用价值.

[1] Marx M, Staparic M, Schieber A, et al. Effects of thermal processing on trans‐cis‐isomerization of β‐carotene in carrot juices and carotene containing preparations[J]. Food Chem, 2003, (83):609‐617.

[2] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局. GB5009.83-2016 食品安全国家标准食品中胡萝卜素的测定[S].北京: 中国标准出版社.

[3] Schierle J, Schellenberger T, Fizet C , et all. A simple Spectrophotometric determination of total β‐carotene in food additives with varying E/Z‐isomer ratios using an isobetestic wavelength [J]. Eur Food Res Technol, 2002 ,215 (3) :268‐274 .

Determination of β-carotene in Feed Additive by Spectrophotometry

YU Zhe‐gao1, ZHAO Xiao‐yang2*

(1. DSM Nutritional Products China Research Center, DSM China Co. Ltd, Shanghai 201203,China;2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural product, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081,China)

To establish a quantitative method to determination of β‐carotene in feed additive by spectrophotometry,based on isobestic wavelength of β‐carotene. β‐carotene powder is disclosed by enzymatic treatment and then extracted with dichloromethane and ethanol, followed by dilution with cyclohexane. The Absorbance is measured at a wavelength of 421.0 nm. The relative standard deviation is 2.52%, the results of this method is consistent with the results of AOAC 2005.7 method. The method has a good linearity in the range of 0.6~6 μg/mL with the correlation coefficient R2=0.999 8.This method is simple, reliable and economical.

Spectrophotometry; Isobestic wavelength; β‐carotene; Feed additive

S816;O657.7

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-113

2017-10-19;

2017-10-26

虞哲高(1965-),男,高级工程师,研究方向为食品 / 饲料领域应用开发,E‐mail‐Zhe‐Gao@dsm.com

* 通讯作者:赵小阳(1962-),女,高级实验师,主要从事农业质量标准与检测技术研究,E‐mail‐zhaoxiaoyang@caas.cn