4种含七叶苷培养基对单增李斯特菌检测效果的比较研究

胡 朋 王 磊 何艳玲，2*

（1.北京陆桥技术股份有限公司 北京 100123；2.中国检验检疫科学研究院）

4种含七叶苷培养基对单增李斯特菌检测效果的比较研究

胡 朋1王 磊1何艳玲1，2*

（1.北京陆桥技术股份有限公司 北京 100123；2.中国检验检疫科学研究院）

为了比较研究4种含七叶苷的单增李斯特菌选择性分离培养基 （PALCAM、OXA、OXA和LPM）对单增李斯特菌的检测效果，参考国标GB4789.28-2013的方法对4种选择性分离培养基上目标菌的生长率和非目标菌的抑制性进行比较；通过人工污染样品试验比较4种分离培养基对单增李斯特菌的检测效果。结果显示目标菌在LMP上的生长率最低，其余3种分离培养基的生长率差异不大；综合比较对非目标菌的抑制性，PALCAM最佳；样品中添加阳性菌株实验表明LMP的灵敏度最低；检测杂菌较少的样品时，PALCAM、OXA和MOX的选择性灵敏度差异不大，而检测杂菌较多的样品时，PALCAM的选择性灵敏度最高。

单增李斯特菌；分离培养基；生长率；灵敏度

1 前言

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）为重要的食源性致病菌，虽然当前有很多快速检测方法已成功应用于该菌的检测，但获得活的细菌分离株仍然是流行病学调查和常规检测中的关键步骤。为了获得分离培养的单增李斯特菌，一般是先经过选择性肉汤增菌，然后将肉汤培养物接种单增李斯特菌的选择分离平板[1]。由于不同的选择体系对单增李斯特菌的分离效果不同，国内外标准在检测样品中的单增李斯特菌时一般选用两种不同选择体系的分离培养基——李斯特菌显色培养基和含七叶苷的分离培养基。含七叶苷的分离培养基有很多，如ISO标准以OXA和PALCAM为选择性分离培养基[2]；美国FDA标准以OXA、PALCAM、LPM和MOX为选择性分离培养基[3]；AOAC Official Method以OXA和LPM为选择性分离培养基[4]；2016版食品安全国家标准GB4789.30-2016《单核细胞增生李斯特氏菌检验》以PALCAM为选择性分离培养基[5]。为了比较上述4种含七叶苷的分离培养基对单增李斯特菌检测效果的影响，本研究通过培养基生长特性、选择性以及人工污染样品实验对4种分离培养基进行比较，为广大检测工作者选择合适的检测方法提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 培养基

牛津琼脂（OXA）、PALCAM培养基（PALCAM）、琼脂（LPM）、改良牛津琼脂（MOX）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、脑心浸液肉汤：以上培养基均由北京陆桥技术股份公司提供。

2.1.2 试验菌株

单 增 李 斯 特 菌 （Listeria monocytogenes）（ATCC19111）、单增李斯特菌 （Listeria monocytogenes）（ATCC19115）、大肠埃希菌（Escherichia coli）（ATCC25922）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）（ATCC29212）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC6538）：以上菌株购于ATCC菌株保藏机构。

2.1.3 样品

需冷藏的奶类（酸奶、巴氏消毒奶）、常温储存奶类（巴氏灭菌酸奶、利乐包纯牛奶）、速冻包类（速冻饺子、包子）、肉馅类、生食蔬菜类、熟食类（凉拌菜、熟肉、真空包装即食肉类）、蛋糕类（面包、蛋糕、饼干）、豆制品类（即食包装豆腐、豆丝、豆干）、雪糕类（冰棍、冰激凌）：共9类101个样品，均购于某大型超市。

2.2 方法

2.2.1 生长率试验

采用定量方法进行，参考GB 4789.28-2013《食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[6]。将上述菌株分别接种到脑心浸液肉汤，置36℃±1℃培养24 h；将肉汤进行10倍梯度稀释，单增李斯特菌选取10-6～10-7浓度的菌悬液各0.1mL涂布于各选择性分离培养基，同时接种参比培养基TSA-YE，每种培养基进行5个重复，于36℃±1℃培养24～48 h。

选择菌落数适中的平板进行计数，按下列公式计算生长率PR。

式中：PR-生长率；NS-待测培养基平板上得到的平均菌落数；N0-参比培养基平板上获得的平均菌落数

2.2.2 对非目标菌的抑制性试验

采用半定量方法进行，参考GB 4789.28-2013。

2.2.3 选择性灵敏度试验

在食品样品中分别添加10-8、10-9两个浓度的单增李斯特菌（ATCC19111和ATCC19115），同时对添加的菌量以倾注法计数，经过LB1和LB2两步增菌后，定性方法接种4种选择性分离培养基。同时以无样品添加的培养基为对照。

3 结果

3.1 4种分离培养基的生长率比较

生长率试验结果见表1和表2。结果显示，两株单增李斯特菌 （ATCC19115和 ATCCA19111）在LMP培养基上的生长率最低，其余3种分离培养基的生长率比较接近，差异不大。

表1 单增李斯特菌ATCC19115在4种分离平板上的计数结果（培养48 h）

表2 单增李斯特菌ATCC19111在4种分离平板上的计数结果（培养48 h）

3.2 4种分离培养基对非目标菌的抑制性比较

试验结果见表3。综合考虑4种分离培养基对3种非目标菌的抑制性，PALCAM的抑制性最好。

表3 4种分离培养基对非目标菌的抑制性比较（G值）

3.3 4种分离培养基的选择性灵敏度比较

试验结果见表4、表5。

表4 4种分离培养基的选择性灵敏度比较（样品中添加单增李斯特菌ATCC19115）

表5 4种分离培养基的选择性灵敏度比较（样品中添加单增李斯特菌ATCC19111）

（1）4种分离培养基对样品中添加单增李斯特菌ATCC19115和ATCC19111的选择性分离效果无差别。

（2）LPM琼脂的选择性灵敏度最低，含杂菌较少的样品与对照培养基一致，可分离得到少量的单增李斯特菌，而含杂菌较多的样品，则无法分离得到单增李斯特菌。

（3）对于其余的3种分离培养基（PALCAM、OXA、MOX），含杂菌较少的样品与对照培养基一致，3种分离培养基的选择性灵敏度无差异；而对于含杂菌较多的样品，PALCAM培养基的选择性灵敏度最高，所含杂菌最少，分离得到的单增李斯特菌也最多。

（续表5）

4 结论

从生长率试验可以得出，两株单增李斯特菌的阳性菌在LMP的生长率均小于其他3个分离培养基，可能是由于LMP中的营养成分较少，只含有胰酪胨、蛋白胨和牛肉粉，且含量较少，不利于单增李斯特菌的生长。综合评价4种分离培养基对非目标菌的抑制性可以得出，PALCAM的抑制性最好，可能与该培养基中的抑菌成分和抗生素用量有关。

4种分离培养基在人工污染样品试验中，对相对较干净的样品，由于含杂菌较少，对目标菌的干扰性较小，4种分离培养基的选择性灵敏度与其对照试验的结果一致，除了LPM灵敏度较差外，其余3种分离培养基无明显差异；而对相对较脏的样品，由于杂菌含量较多，与目标菌呈竞争生长的关系，从而影响目标菌的分离。综合以上相对较脏样品的分离结果，只有PALCAM对目标菌的分离效果与对照试验保持一致，而OXA和MOX在检测某些样品时分离得到的目标菌很少，只在一区有培养基变黑的现象，难以得到单菌落，需要多次分纯，说明OXA和MOX培养基受样品中杂菌的影响较PALCAM大。综上所述，PALCAM是单增李斯特菌选择性分离的理想培养基。

[1] 程洁，张晓峰.单增李斯特菌选择性增菌培养和分离方法的比较研究[J].检验检疫科学，2003，13（6）：36-38.

[2] ISO 11290-1：1996 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for thedetection and enumeration of Listeria monocytogenes-part1：Detection method[S].

[3] Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods// Bacteriological Analytical Manual，2016，Chapter 10.

[4] Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products[S].AOAC Official Method 993.12，1993.

[5] GB4789.30-2016单核细胞增生李斯特氏菌检验[S].

[6] GB 4789.28-2013食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求[S].

Comparative Study on the Effect of Four Kinds of Aescin-Containing Cultures on the Detection of Listeria monocytogenes

HU Peng1，WANG Lei1，HE Yanling1，2*
（1.Beijing Landbridge Technology Co.，Ltd.，Beijing，100123；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine）

In order to study the effects of fourdifferent seizures ofListeria monocytogenes（PALCAM，OXA，OXA and LPM）onListeria monocytogenes，the results with GB4789.28-2013 method was used to compare the growth rate of target bacteria and the inhibition of non-target bacteria on four selective isolation medium.And the testing effects of four mediums toListeria monocytogenesby artificially polluted samples were compared.The results showed that the growth rate of target bacteria was the lowest in LMP，the other three kinds of mediums were notdifferent.Comparing with the inhibition on non-target bacteria，PALCAM was the best.The positive strains added experiment showed that the selective sensitivity of PALCAM，OXA and OXA was not verydifferent when samples with less bacteriadetected. And the selective sensitivity of OXA/MOX was not as good as that of PALCAM when samples with more bacteriadetected.

Listeria monocytogenes；Isolate Medium；Growth Rate；Selective Sensitivity

TS207.4

E-mail：181771026@qq.com；*通讯作者E-mail：154622052@qq.com

2017-03-13