液相色谱-串联质谱法测定蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物的残留量

时逸吟 李 优 伊雄海 张 怡 盛永刚 邓晓军 郭德华

（上海出入境检验检疫局 上海 200135）

液相色谱-串联质谱法测定蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物的残留量

时逸吟 李 优 伊雄海 张 怡 盛永刚 邓晓军 郭德华

（上海出入境检验检疫局 上海 200135）

建立了液相色谱-串联质谱测定蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢产物的分析方法。样品经酸性乙腈提取，QuEChERS法净化，XDB-C18色谱柱（50mm×4.6 mm，1.8 μm）分离，并以含0.1%（v/v）甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液-含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，电喷雾负离子模式电离，多反应监测模式检测，基质匹配外标法定量。结果表明氟虫腈及其代谢物在0.2～10μg/L范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.99。方法检出限（S/N＞3）和定量限（S/N＞10）分别为0.2μg/kg和2μg/kg。在不同基质中，氟虫腈及其代谢物在2、5、20μg/kg的添加水平下平均加标回收率为74.6%～113%，相对标准标准偏差为2.21%～14.0%（n=6）。该方法有效补偿了液相色谱-串联质谱检测过程中的离子化抑制效应，灵敏度和准确度高，适用于鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱中氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的测定。

蛋及蛋制品；氟虫腈及其代谢物；液相色谱-串联质谱；QuEChERS

1 前言

氟虫腈（Fipronil）又称芬普尼、锐劲特，为苯基吡唑类杀虫剂。动物实验研究表明，短期摄取大量氟虫腈会对神经系统造成不良影响，长期摄取氟虫腈可能会损害肝脏、甲状腺和肾脏[1]。2017年7月，比利时有关部门发现荷兰鸡蛋含有氟虫腈，同年8月欧洲16个国家、香港、台湾相继在鸡蛋中发现氟虫腈，使“毒鸡蛋”事件发酵成世界范围内的重大食品安全事件，为我国蛋及蛋制品的安全敲响了警钟。

目前世界各国已对鸡蛋中氟虫腈的残留量制定了最大限量标准 （MRL）。其中，国际食品法典委员会（CAC）的规定MRL值为0.02mg/kg[2]；美国为0.15mg/kg[3]；欧盟为0.005mg/kg，以氟虫腈和MB46136之和计[4]；日本肯定列表为0.02mg/kg。我国食品安全国家标准GB 2763-2016《食品中农药最大残留限量》对谷物、果蔬、糖料、食用菌和油脂中的氟虫腈制订了残留限量，以氟虫腈、氟甲腈（MB46513）、MB46136、MB45950之和计[5]，具体化合物信息见图1，并对茶叶、果蔬、鸡肉中的氟虫腈制订了检测标准[6-9]，也有较多文献报道了植物性食品中氟虫腈的检测方法[10-15]，但是未见蛋及蛋制品中氟虫腈检测方法的文献和标准，为技术执法带来困难，因此建立蛋及蛋制品中氟虫腈的检测方法，对严防 “毒鸡蛋”入境、保障国内蛋和蛋制品安全具有重要意义。

图 1 氟虫腈及其代谢物的化合物信息

目前食品中氟虫腈的检测方法有气相色谱法（GC）[10，11，13]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[12-14]、液相色谱法（LC）[15]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/ MS）[16]。其中，LC-MS/MS法因其技术成熟、灵敏度和准确性高，已被广泛应用于食品中农药残留的检测。胡贝贞等[16]采用该技术对茶叶中的氟虫腈进行了测定，然而对于蛋及含蛋食品中氟虫腈残留量的检测缺乏定性、定量检测方法。本项目采用QuEChERS法前处理，建立快速、准确、灵敏度高的HPLC-MS/ MS法测定蛋及蛋制品中氟虫腈的含量。QuEChERS法具有操作快速简便、试剂消耗少、环境污染小的优点，已成为果蔬中农药残留检测和水产品中兽药残留检测的常用前处理手段。本方法的建立能够及时有效地应对突发性、大批量、多种蛋及蛋制品中氟虫腈的检测任务，填补我国氟虫腈检测技术存在的空白，为执法部门提供执法依据，保障人民的食品安全。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样品

鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱：均由市场采购。

2.1.2 试剂

乙腈：色谱纯，迪马科技有限公司；乙酸铵、无水硫酸镁、氯化钠、二水合柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲酸：纯度98%，美国Sigma-Aldrich公司；十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、石墨化炭黑（GCB）：上海安谱实验科技有限公司；氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈标准品：纯度>98%，德国Dr.Ehrensorfer公司；实验用水：由Milli-Q超纯水系统制得。

2.1.3 仪器

液相色谱-串联质谱联用仪：美国AB公司；PL602-L电子天平：瑞士 Mettler-Toledo公司；Centrifuge 5810R离心机：德国 Eppendorf公司；KMC-1300V触式振荡器：韩国Vision公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液配制

分别准确称取适量氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈标准品，用乙腈溶解并定容，配制质量浓度为1 000mg/L的标准储备液，于-18℃避光保存；移取各标准储备液，根据需要用空白基质溶液逐级稀释，并配制适当浓度的标准工作液，现用现配。

2.2.2 样品前处理

2.2.2.1 提取

新鲜鸡蛋去壳后搅拌混匀；鸡肉、鸡内脏、蛋糕和鸡蛋面用粉碎机捣碎；蛋黄酱直接使用。称取4 g试样（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加入10mL水，放入陶瓷均质子，加入10mL含1%甲酸的乙腈提取，剧烈振荡1min。快速加入4.0 g无水硫酸镁、1.0 g氯化钠、1.0 g二水合柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二钠盐，剧烈振荡1min，静置5min，再次剧烈振荡1min，以4 500 r/min离心10min，吸取6mL上清液于15mL离心管中，待净化。

2.2.2.2 净化

在上述提取液中加入150mg C18、150mg PSA、900mg无水硫酸镁和15mg GCB粉末，振荡2min，以4 500 r/min离心5min，取0.5mL上述提取液，乙腈定容至1mL，过0.45 μm滤膜，供LC-MS/MS测定。

2.2.3 液相色谱-质谱条件

2.2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；柱温：30℃；进样量10 μL；流动相A：含0.1%（v/v）甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液；流速：0.4mL/min；进样量10 μL。梯度洗脱程序：0～2.0min，2%B；2.0～11.0min，99%B；11.0～15.0min，2%B；流速：0.4mL/min。

2.2.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方法：负离子扫描；监测模式：多反应监测（MRM）；雾化气（Gas1）流量：55.0 L/h；加热辅助气（Gas2）流量：55.0 L/h；气帘气（Curtain gas）流量：30.0L/h；喷雾电压（IS）：5500V；氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的保留时间、定性离子、定量离子、碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）和碰撞室出口电压（CXP）等质谱参数见表1。

表1 氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的保留时间、母离子、子离子及其他质谱参数

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

根据氟虫腈及其代谢物的化学结构[17]，本项目选用Agilent XDB-C18色谱柱，分别比较了乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、酸性乙腈-酸性乙酸铵水溶液3种不同组成的流动相对目标化合物的分离效果和灵敏度。结果表明，酸性乙腈-酸性乙酸铵水溶液体系下氟虫腈及其代谢产物的峰性和灵敏度要高于乙腈-水和乙腈-甲酸水溶液体系[16]；故本项目采用酸性乙腈-酸性乙酸铵水溶液，通过梯度洗脱，氟虫腈及其代谢产物的色谱图如图2所示。

图2 氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈标准溶液（1μg/L）在MRM模式下的色谱图

3.2 质谱条件的优化

分别取1mL 100μg/L的氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈标准工作液，利用流动注射泵进样，在负离子模式下进行一级质谱全扫描，氟虫腈及其代谢物的化学结构中含有NH2基团，因此在负离子模式下较易失去H+而形成准分子离子[17]，见图3。同时优化其去簇电压（DP）和碰撞室入口电压（EP），再以准分子离子进行二级质谱扫描，选择丰度较高的2个碎片离子分别作为定量与定性离子，并优化其碰撞能量（CE）和碰撞室出口电压（CXP）。氟虫腈及其代谢物的相关质谱参数见表1。氟虫腈及其代谢物在正离子模式和负离子模式下均有响应，但是在同样的混合标准品浓度下，正离子模式下的响应值远远低于负离子模式，故最终选择了灵敏度更好的负离子模式对目标化为进行测定。

图 3 氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的母离子和子离子全扫描质谱图

3.3 前处理条件的优化

3.3.1 提取溶剂的优化

选择阴性鸡蛋样品为试验材料，添加5.0μg/kg混合标准溶液，采用基质匹配外标法对萃取溶剂进行优化。萃取溶剂选取了QuEChERS方法中常用的4种试剂：乙酸乙酯、甲醇、乙腈和1%甲酸-乙腈（1∶99，v/v）。结果表明，用乙酸乙酯和甲醇提取时，氟虫腈及其代谢物的回收率<60%，达不到检测要求；用乙腈、酸化乙腈提取时，回收率均可满足检测方法的要求，但是乙腈提取时，基质影响较大；在加入1%甲酸后，减少了基质对氟虫腈及其代谢物的干扰。因此，本项目选择1%甲酸-乙腈（1∶99，v/v）为提取溶剂（图4）。

图 4 不同提取溶剂对氟虫腈及其代谢物回收率的影响

3.3.2 净化条件的优化

目前常用的吸附剂主要有C18、PSA、GCB和无水硫酸镁。本项目选择阴性鸡蛋为试验材料，添加5.0μg/kg混合标准溶液，采用基质匹配外标法对萃取溶剂进行优化[18]。图5表明，C18用量在50～200mg范围内，氟虫腈及其代谢物的回收率在38%～101%之间，C18用量为150mg时氟虫腈及其代谢物回收率达到最高 （85%～101%）；PSA用量在50～200mg范围内，氟虫腈及其代谢物的回收率在37%～99%之间，PSA用量为150mg时氟虫腈及其代谢物回收率达到最高（84%～99%）；无水硫酸镁用量在300～900mg范围内，氟虫腈及其代谢物的回收率在41%～ 104%之间，无水硫酸镁用量为900mg时氟虫腈及其代谢物回收率达到最高（88%～104%）；GCB用量在10～25mg范围内，氟虫腈及其代谢产物的回收率在67%～101%，GCB用量为15mg时氟虫腈及其代谢物回收率达到最高（87%～101%）。本项目最终选择150mg C18、150mg PSA、900mg无水硫酸镁和15mg GCB粉为最佳净化条件。

3.4 方法验证

3.4.1 基质效应

基质效应（ME）在LC-MS/MS分析中普遍存在，且随仪器试剂和样品基质的不同而表现不同，对ESI源具有明显的离子化抑制作用，影响检测灵敏度准确度与精密度。目前，主要通过优化前处理条件、添加同位素内标、优化色谱分离条件、修正质谱分析参数等方法来消除基质效应[19]。本项目考察了鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱的基质效应，在纯试剂和不同基质提取液后添加标样，比较目标物在纯试剂和基质液中的信号峰面积，得到基质响应相对强度（ME）为：基质标样的峰面积/试剂标样的峰面积×100%。当ME>100%时，表明存在离子化增强效应；当ME<100%时，表明存在离子化抑制效应。结果表明，在含水量较高的鸡蛋和鸡肉样品中基质效应在80%～120%之间，基质效应不明显；在蛋糕和鸡蛋面样品中基质效应<80%，表现为基质抑制效应，可能是较低的含水量浓缩了基质共萃物，导致基质效应较显著。除此之外，在高油脂的蛋黄酱样品中基质效应<80%，表明油脂含量对基质抑制的效果形成一定影响，这与报道过的基质组分对基质效应的影响结论类似[20]。本项目选用基质匹配溶液校正方法对基质效应补偿，从而保证检测结果的准确性。

3.4.2 方法检出限（LOD）、定量限（LOQ）和线性关系

准确量取适量混合标准储备工作液，用空白鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱基质液稀释，配制混合标准品工作液。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标，氟虫腈及其代谢产物在0.2μg/L～ 10μg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数（r2）均大于0.99。以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N= 10）确定氟虫腈及其代谢物的LOD和LOQ，分别为0.2μg/kg和2μg/kg，结果见表2。

表2 氟虫腈及其代谢产物的线性回归方程、相关系数及LOD、LOQ

3.4.3 准确度和精密度

在鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱基质中添加2、5、20μg/kg的氟虫腈及其代谢物标准品，按2.2.2节进行前处理，进行加标回收率试验（n=6）。结果表明：鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱基质的平均加标回收率分别为70.2%～ 109%、76.0%～106%、79.8%～119%、70.5%～107%、71.0%～112%、71.0%～120%，RSD分别为 5.64%～ 14.0%、3.15%～9.74%、2.21%～9.41%、2.80%～13.3%、2.32%～9.31%、2.16%～9.43%（表3）。空白鸡蛋样品和添加2μg/kg氟虫腈及其代谢物鸡蛋样品的选择性离子色谱图分别见图6和图7。结果显示，鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢产物的色谱峰峰型良好，基质干扰少。说明该方法准确、稳定、精密度高，符合残留检测要求。

表3 鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱中氟虫腈及其代谢产物的平均加标回收率和相对标准偏差（n=6）

图5 空白鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢产物的选择性离子色谱图

图6 加标鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢产物（2μg/kg）的选择性离子色谱图

3.5 实际样品测定

对市售170例市售鸡蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱进行检测，其中6批次鸡蛋样品测出氟虫腈砜，含量为0.006～3.8mg/kg，4批次蛋糕样品测出氟虫腈砜，含量为0.007～0.068mg/kg。图7为阳性鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物的选择性离子色谱图。

图7 氟虫腈砜阳性鸡蛋样品的选择性离子色谱图

4 结论

本研究建立了液相色谱-串联质谱测定蛋、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱中氟虫腈及其代谢产物含量的分析方法。采用QuEChERS前处理法进行提取净化，对多种食品基质的净化效果良好。通过基质匹配外标法定量可同时补偿所有食品基质中的基质效应，有效提高定量的准确性，扩大方法的适用范围。方法的检出限、回收率、精密度等均满足我国对食品中氟虫腈及其代谢产物含量的检测要求，可作为分析确证的储备方法。

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Determination of Fipronil and Its Metabolites in Egg and Egg Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHI Yiyin，LI You，YI Xionghai，ZHANG Yi，SHENG Yonggang，DENG Xiaojun，GUO Dehua
（Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai，200135）

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） was established for thedetermination of fipronil its metabolites in egg and egg products.The samples were extracted with acid-acetonitrile，cleaned up by QuEChERS method.The separation was performed on an XDB-C18column（50mm×4.6mm，1.8μm）with the mobile phases of 5mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% （v/v） formic acid and acetonitrile containing 0.1% （v/v） formic acid.The identification and quantitation of fipronil and its metabolites were performed by MS/MS in negative electrospray ionization（ESI-）and multiple reaction monitoring （MRM）mode.The quantitative analysis was carried out by external standard method.A good linear relationship，with the correlation coefficient（r2）greater than 0.99，was found in the mass concentration range of 0.2-10μg/L.The limit ofdetection （LOD，S/N＞3）and limit of quantitation（LOQ，S/N＞10）were 0.2μg/kg and 2μg/kg respectively.The recoveries of fipronil and its metabolites indifferent matrixes spiked with 2，5，20μg/kg varied from 74.6%to 113%，and the relative standarddeviations（RSDs）were between 2.21%and 14.4% （n=6）.The method can effectively correct the ionization suppression，and it is sensitive，accurate and suitable for the monitoring of fipronil，fipronil sulfide，fipronil sulfone and fiponildesulfinyl in egg，chicken，chicken entrails，egg noodle，cake and mayonnaise.

Egg and Egg Products；Fipronil and Its Metabolites；Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry（LC-MS/MS）；QuEChERS

O657.7+2

E-mail：shiyy@shciq.gov.cn

上海市技术标准专项 （17DZ2201100）

2017-09-01