探讨卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达及其在浆液性癌细胞增殖中的作用

侯祥位+陈立侠

【摘要】 目的：探讨Rap1蛋白卵巢浆液性癌组织中的表达及其在浆液性癌细胞增殖中的作用。方法：对笔者所在医院2015年4月-2017年4月手术切除的卵巢标本资料实施统计分析，其中20份为浆液性卵巢癌组织标本，良性肿瘤组织标本10份。另对同期手术切除的正常卵巢组织标本10份的临床资料进行统计分析，进行细胞培养、Western blot检测，设计siRNA靶序列，构建靶向Rap1 的siRNA 真核表达载体，建立SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株，进行MTT实验，然后对卵巢浆液性癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达、SKOV3细胞增殖受Rap1基因下调的影响进行分析。结果：卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达线显著高于良性肿瘤、正常卵巢组织，差异有统计学意义（P<0.05），但良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）；Rap1组细胞的增殖速度显著高于Empty、WT、NT.Cont组细胞，差异有统计学意义（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont组细胞的增殖速度比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达较高，其会对浆液性癌细胞增殖进行抑制。

【关键词】 卵巢浆液性癌组织； Rap1蛋白表达； 浆液性癌细胞增殖； 作用

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.25.028 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）25-0055-02

為了将浆液性癌细胞增殖中Rap1蛋白表达的作用阐明，本研究对卵巢浆液性癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达进行了比较，同时将Rap1 shRNA真核表达载体构建了起来，在此过程中将RNA干扰技术充分利用了起来，并建立了SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株筛选，对SKOV3 细胞增殖能力（Rap1表达缺失）的变化进行检测，在此过程中运用MTT法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

对笔者所在医院2015年4月-2017年4月手术切除的卵巢标本的临床资料进行统计分析，纳入标准：所有患者均具有完整的临床病历资料。排除标准：将合并其他系统恶性肿瘤、术前接受放化疗治疗等卵巢癌患者排除在外。其中20份为液性卵巢癌组织标本，良性肿瘤组织标本10份。另对同期手术切除的正常卵巢组织标本10份的临床资料进行统计分析，所有标本均以子宫肌瘤为原发病。切除离体后的标本第一时间放置在液氮中保存备用。病理科医师阅片对所有标本的病理诊断进行证实。采用笔者所在医院实验研究中心提供的感受态宿主菌大肠杆菌DH-5α，购买美国Oligo-engine公司生产的pSUPER.retro.neo/GFP（Empty）真核表达载体，GFP、Neo、Amp分别为绿色荧光标记、真核筛选基因（G418）、氨苄抗性基因。EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ为酶切位点，含H1启动子。购买重庆医科大学病理学教研室提供的卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3。本课题组在前期工作中已经将阴性质粒（NT）、空载体（Empty）建立了起来。购买宝生物工程（大连） 有限公司生产的限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、兔抗Rap1单克隆抗体，美国Invitrogen公司生产的脂质体LipofectamineTM2000，美国Progema公司生产的T4DNA连接酶，HyClone公司生产的胎牛血清、RPM1640培养基。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 常规培养SKOV3-Rap1-RNAi 稳定转染细胞株（Rap1i-1）、SKOV3细胞野生型（WT）、阴性质粒（NT.cont）、空载体（Empty）转染细胞株，位置为RPM1640培养基，实验细胞呈对数生长[1]。

1.2.2 Western blot检测 将总蛋白提取出来，途径为对各组组织及细胞进行裂解，然后对蛋白浓度进行测定，然后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）前将60μg总蛋白从每个上样孔取出来，转膜，ECI显色前孵育，孵育过程中将抗体充分利用起来。成像过程中将凝胶成像仪充分利用起来，然后将各组蛋白条带的灰度值计算出来，计算过程中将Quantity One图像分析软件充分利用起来。蛋白相对表达量=蛋白条带的灰度值/内参灰度值[2]。

1.2.3 设计siRNA靶序列 对人Rap1基因全序列（NM_001010935.1）全长序列进行检索，检索过程中将GenBank充分利用起来，将3对Rap1 siRNA序列设计出来，Rap1 shRNA1基因序列为5-GATCCCCTGCCAACAGTGTATGCTCGTTCAAGAGACGAGCATACACTGTTGGCATTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA2基因序列为5-GATCCCCGATGAGCGAGTAGTTGGCATTCAAGAGATGCC-AACTACTCGCTCATCTTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA3基因序列为5GATCCCCAGTGGTGTAACTGTGCCTTTTCAAGAGAAAGGCACAGTTACACCACTTTTTTGGAAA-3。其含19 nt，设计过程中将Oligoengine RNAi设计软件充分利用起来，并对siRNA设计原则进行严格遵循，合成主体为invitrogen[3]。

1.2.4 构建靶向Rap1 的siRNA 真核表达载体 将正义链、反义链退火，其由化学合成，将良好的前提条件提供给shRNA表达模板的形成，连接pSUPER.retro.neo/GFP 质粒，其经BglⅡ、HindⅢ双酶切后线性化，然后向感受态宿主菌大肠杆菌DH-5α转化，将质粒提取出来，双酶切重组质粒，在此过程中将限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ充分利用起来，37 ℃水浴4 h，之后电泳分析，在此过程中将1%琼脂糖凝胶充分利用起来。向invitrogen送往进行DNA测序鉴定前保证质粒经双酶切鉴定成功[4]。endprint

1.2.5 建立SKOV3-Rap1-RNAi稳定转染细胞株 将对数生长期的SKOV3细胞取出来，细胞满意度达70%～80%后转染，同时将多个单克隆细胞筛选制备出来，在此过程中将G418充分利用起来，进一步扩大培养，将Rap1具有最显著沉默效果的稳定转染细胞株筛选出来前将总蛋白提取出来，在此过程中将免疫印迹筛选出来[5]。

1.2.6 MTT试验 将200 μl细胞悬液取出来，有2000个细胞存在于每孔，向96孔板中对细胞进行接种，每组5个复孔，同时将空白孔设立出来调零，共将7个培养板接种出来，在孵箱中放置进行常规培养。接种细胞，一周内每天取1个96孔板，加入20μl的5mg/ml 噻唑蓝（MTT）溶液，在细胞培养箱中继续放置进行4 h的孵育，将培养终止，将孔内细胞培养上清液小心吸弃，在此过程中将1 ml注射器充分利用起来。将150 μl二甲亚砜（DMSO）再加入到每孔中，进行10 min的振荡，对结晶物进行充分溶解。将570 nm波长选取出来，对各孔光密度值进行测定，位置为酶标仪，并将结果详细记录下来，将纵坐标设定为光密度值，将横坐标设定为时间，将细胞生长曲线绘制出来[6]。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢浆液性癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达比较

卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达为（1.190±0.062）%，显著高于良性肿瘤、正常卵巢组织的（0.613±0.080）%、（0.402±0.052）%，差异有统计学意义（P<0.05），但良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05），具体见图1。

2.2 SKOV3细胞增殖受Rap1基因下调的影响

Rap1组细胞的增殖速度为（1.5±0.2），显著高于Empty、WT、NT.Cont组细胞的0、（1.0±0.2）、（0.9±0.1），差异有统计学意义（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont组细胞的增殖速度比较差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

3 讨论

在妇科恶性肿瘤病死率中，卵巢癌位居首位，对妇女的健康及生命造成了严重威胁[7]。在肿瘤的浸润及转移中，肿瘤细胞内的各种信号通路发挥着不同的作用，Rap1属于类Ras家族成员，是一种分子开关，在细胞增殖、形态发生等多种信号通路中参与对其进行调节[8]。相关医学研究表明，Rapl活性一旦失调，恶性肿瘤就会发生发展，同时Rapl有细胞特异性功能，比如，对NIH3T3细胞及星形胶质细胞（Ras转染）增殖进行抑制，但是却为Swiss3T3细胞DNA合成提供良好的前提条件，促进细胞增殖速度的加快[9-11]。本研究结果表明，卵巢浆液性癌组织中Rap1蛋白表达线显著高于良性肿瘤、正常卵巢组织，差异有统计学意义（P<0.05），但良性肿瘤、正常卵巢组织中Rap1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；Rap1组细胞的增殖速度显著高于Empty、WT、NT.Cont组细胞，差异有统计学意义（P<0.05），说明Rap1蛋白卵巢浆液性癌组织中的表达较高，其会抑制浆液性癌细胞增殖，值得临床充分重视。

参考文献

[1]高一萌，张瑜，李文燕，等.C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢癌浸润中的作用[J].第三军医大学学报，2012，34（11）：1031-1034.

[2]黄琳玲，于晓红.B7-H1 在卵巢浆液性囊腺癌中的表达及临床意义[J].南昌大学学报，2012，52（8）：50-56.

[3]孔北华.重视卵巢癌的二元论模型与卵巢外起源新说[J].中华妇产科杂志，2011，46（10）：721-723.

[4]郑庆玲，冯一中，顾栋桦，等.Fascin 在卵巢浆液性肿瘤中的表达及其临床意义[J].江苏医药，2012，38（6）：699-701.

[5]朱瑾，孙红.复旦大学附属妇产科医院卵巢浆液性腺癌10年回顾分析[J].现代妇产科进展，2011，20（1）：48-53.

[6]侯锐，姜罗，刘大我，等.黏蛋白MUC1 在卵巢浆液性肿瘤中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学，2012，20（6）：1250-1253.

[7]程一姗，孔红霞，杨立.输卵管结扎对卵巢癌影响的临床分析[J].中国实用医刊，2013，40（5）：53-55.

[8]彭娟，江庆萍，刘少颜.SOX4 和p53 在卵巢浆液性乳头状癌中的表达及意义[J].广东医学杂志，2012，33（15）：2313-2316.

[9]庞淑洁，郑文新，郭東辉.盆腔高级别浆液性腺癌与输卵管伞端病变研究进展[J].临床与实验病理学杂志，2012，28（2）：196-198.

[10]魏丽，刘萌萌，曹汴英.46 例卵巢浆液性癌的临床病理分析[J].中国保健营养，2013，12（2）：82-83.

[11]郭天坤.血清可溶性B7-H4 水平对卵巢癌早期诊断和疗效评价的价值[J].国际检验医学杂志，2011，32（21）：2460-2465.

（收稿日期：2017-05-15）endprint