柴胡疏肝散对功能性消化不良大鼠胃排空的促进作用及机制

周洲，凌江红，徐宽，张丽敏，张钰琴，王煜姣，谢天一

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

柴胡疏肝散对功能性消化不良大鼠胃排空的促进作用及机制

周洲，凌江红，徐宽，张丽敏，张钰琴，王煜姣，谢天一

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的观察柴胡疏肝散对功能性消化不良(FD)大鼠胃排空的促进作用，并探讨其作用机制。方法将24只健康成年SD大鼠随机均分为正常组、模型组、柴胡疏肝散组与多潘力酮组。除正常组外，其余各组均采用夹尾刺激法制备FD模型。各组均于造模第1天给予药物干预，柴胡疏肝散组、多潘立酮组分别给予0.63 g/mL柴胡疏肝散水煎剂1.5 mL、0.6 mg/mL多潘立酮水溶液1.5 mL灌胃，正常组、模型组均给予生理盐水1.5 mL灌胃，2次/d，共干预4周。末次给药后24 h,各组予以营养性半固体糊(1.5 mL/100 g体质量)灌胃，30 min后麻醉开腹，剪取完整胃，根据全胃重、空胃重计算胃排空率。用HE染色法观察胃窦部黏膜组织病理变化，用免疫组化法检测胃窦部黏膜组织中蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和磷酸化真核翻译起始因子2α(p-eIF2α)蛋白表达。结果与正常组比较，模型组大鼠胃排空率低(P<0.05)；与模型组比较，柴胡疏肝散组、多潘立酮组胃排空率高(P均<0.05)。模型组、柴胡疏肝散组和多潘立酮组胃窦组织可见少量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织内PERK、p-eIF2α蛋白表达高(P均<0.05)；与模型组比较，柴胡疏肝散组、多潘立酮组胃窦组织内PERK、p-eIF2α蛋白表达低(P均<0.05)。结论柴胡疏肝散可能通过调控内质网应激信号通路PERK/eIF2α促进FD大鼠胃排空。

功能性消化不良；柴胡疏肝散；中药；内质网应激；蛋白激酶R样内质网激酶;磷酸化真核翻译起始因子2α；大鼠

功能性消化不良(FD)是由胃和十二指肠功能紊乱引起的一系列消化道症状[1]。研究表明，胃肠动力障碍是其重要的发病机制，并且精神心理障碍如抑郁焦虑、情志不舒等是其重要的促发因素[2]。柴胡疏肝散为疏肝理气最具代表性的方剂之一，具有疏肝解郁、理气止痛的功效，主治肝郁气滞证。现代临床及实验研究均表明，柴胡疏肝散对FD具有良好疗效，能明显缓解症状，但具体作用机制尚不清楚[3，4]。本课题组前期研究发现，柴胡疏肝散具有促胃动力作用，并且其机制可能与抑制FD大鼠胃窦组织中胃动力相关细胞的自噬有关[5]。有研究表明，内质网应激可通过蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/磷酸化真核翻译起始因子2α(eIF2α)信号通路调控自噬[6]。2016年10月～2017年6月，本研究观察柴胡疏肝散对FD大鼠胃排空的促进作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器来源 清洁级SD大鼠24只，雌雄各半，体质量(150±10)g，由广西医科大学实验动物中心提供，其合格证号：SCXK桂2015-0003。柴胡疏肝散(柴胡6 g、陈皮6 g、川芎4.5 g、枳壳4.5 g、白芍4.5 g、香附4.5 g、炙甘草1.5 g)中药饮片购自广西医科大学第一附属医院，按照中药常规煎法制备成生药含量0.63 g/mL的中药溶液，4 ℃冰箱保存备用。多潘立酮购自西安杨森制药公司，批号150324778，规格10 mg/片，用蒸馏水配制成0.6 mg/mL的药液备用。PERK单克隆抗体由美国Novus公司提供；p-eIF2α单克隆抗体由美国CST公司提供；SP-9000免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂由北京中山金桥生物科技有限公司提供；PBS缓冲液及中性树胶封片剂，由上海碧云天生物科技有限公司提供。RM2235石蜡切片机购自德国Leica公司；CX41光学显微镜及Image-Pro Plus 6.0(IPP6.0)图像分析系统购自日本Olympus公司。

1.2 动物分组、模型制备及药物干预 SD大鼠适应性喂养3 d，随机均分为正常组、模型组、柴胡疏肝散组和多潘立酮组。除正常组外，其余大鼠均参照文献[7]方法进行造模。每日用包裹了海绵的长钳钳夹大鼠尾部末端1/3处，以不破皮为度，令其尖叫或与其他大鼠打斗，每次30 min，2次/d，每2次间隔至少8 h，持续4周。期间如大鼠被抓伤，可用0.5%碘伏消毒受伤部位，以防感染。于造模第1天开始给予药物干预，柴胡疏肝散组给予0.63 g/mL柴胡疏肝散水煎剂1.5 mL灌胃，多潘立酮组给予0.6 mg/mL多潘立酮水溶液1.5 mL灌胃，正常组和模型组均给予生理盐水1.5 mL灌胃，2次/d，共干预4周。

1.3 大鼠胃排空率测算 参照文献[8]，大鼠末次给药后禁食不禁水24 h，予以营养性半固体糊(羧甲基纤维素钠10 g、全脂奶粉16 g、糖8 g、淀粉8 g、蒸馏水200 mL)灌胃，1.5 mL/100 g体质量。30 min后用10%水合氯醛麻醉，开腹，迅速结扎贲门和幽门，剪取完整的胃，滤纸吸干称取重量为全胃重。沿胃大弯剪开胃壁并用生理盐水冲洗干净胃壁，滤纸吸干，称取重量为空胃重。胃排空率(%)=[1-(全胃重-空胃重)/总灌胃量]×100%。

1.4 大鼠胃窦部黏膜组织病理变化观察 采用HE染色法。取大鼠胃窦部黏膜组织，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，取出组织，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，常规切片4 μm，45 ℃水浴中捞片，80 ℃烤箱烤片，30 min；切片放入二甲苯中浸泡10 min×3次；依次放入无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇各2 min，自来水漂洗5次；苏木素染核10 min，自来水漂洗5次；浸入1%盐酸乙醇分化30 s，自来水漂洗5次，碳酸锂饱和水溶液返蓝1 min，流水冲洗15 min；0.5%伊红染浆2～5 min，自来水洗片刻；95%乙醇和无水乙醇各脱水2次，每次2 min；二甲苯脱水透明2次，每次2 min；中性树胶封片，×400镜下观察。

1.5 大鼠胃窦部黏膜组织PERK、p-eIF2α蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。实验过程中用PBS分别代替两种一抗作为空白对照以检验免疫反应特异性。步骤：石蜡切片脱蜡水化，泡入抗原修复液(柠檬酸钠缓冲液)中，高压锅高温修复5 min，自来水洗3次；滴加过氧化氢，避光10 min；PBS泡洗3次，每次5 min；滴加A液(山羊血清)封闭，室温孵育10 min；甩干，滴加一抗(根据抗体说明书及预实验结果，PERK最佳浓度为1∶1 000；p-eIF2α最佳浓度为1∶500)，4 ℃湿盒过夜；复温，PBS洗3次，每次5 min，滴加B液(二抗)，孵育10～30 min；甩干，滴加C液，10 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加新鲜配置的DAB显色剂，2～5 min，显微镜下观察；自来水冲洗，苏木素染色1～2 min；自来水漂洗干净，盐酸酒精泡30 s，自来水泡洗20 min返蓝；晾干，中性树胶封片；用光学显微镜(10×40倍)观察，镜下随机选取5个视野的阳性细胞，用IPP图像分析系统自动检测各个视野的光密度值，并计算平均值作为目标蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠胃排空率比较 正常组、模型组、柴胡疏肝散组、多潘立酮组大鼠胃排空率分别为59.83%±2.41%、45.60%±3.53%、56.68%±2.69%、52.25%±3.54%；与正常组比较，模型组大鼠胃排空率低(P<0.05)；与模型组比较，柴胡疏肝散组、多潘立酮组胃排空率高(P均<0.05)；多潘立酮组与柴胡疏肝散组胃排空率比较，P>0.05。

2.2 各组大鼠胃窦组织病理变化 HE染色结果显示，各组大鼠胃窦组织结构层次清晰，黏膜上皮完整，未见溃疡、增生、化生等病理改变；各组织层中的细胞排列规则。模型组、柴胡疏肝散组和多潘立酮组可见少量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。

2.3 各组大鼠胃窦组织中PERK、p-eIF2α蛋白表达比较 PERK蛋白定位于胞质，细胞着色呈棕黄色为阳性细胞。正常组、模型组、柴胡疏肝散组、多潘立酮组大鼠胃窦组织PERK蛋白表达水平(光密度值)分别为0.018±0.008、0.165±0.034、0.037±0.013、0.021±0.011；p-eIF2α蛋白表达水平(光密度值)分别为0.031±0.029、0.170±0.045、0.094±0.027、0.062±0.019。与正常组比较，模型组大鼠胃窦组织内PERK、p-eIF2α蛋白表达高(P均<0.05)；与模型组比较，柴胡疏肝散组、多潘立酮组胃窦组织内PERK、p-eIF2α蛋白表达低(P均<0.05)；与多潘立酮组比较，柴胡疏肝散组胃窦组织内PERK、p-eIF2α蛋白表达高(P均<0.05)

3 讨论

FD是临床常见的功能性胃肠病。近年来诸多研究表明其病因多与胃肠功能障碍有关[4，9]。胃窦间质细胞和胃窦平滑肌细胞是胃窦组织中最主要的两种细胞，二者与胃肠功能障碍的发生有密切关系[10，11]。研究已经证实，胃窦间质细胞是调节胃肠运动的起搏者，决定着胃肠慢波的形成；而平滑肌细胞作为效应器则决定着胃肠运动的收缩与舒张。有研究表明这两种细胞的数量变化或者结构破坏，可能是导致胃肠动力障碍性疾病的关键[11,12]。本课题组前期研究发现，柴胡疏肝散复方或单味中药枳实治疗FD的机制也与这两种细胞密切相关[13,14]。进一步研究发现，其机制可能与抑制细胞的自噬有关[15]。有研究表明，内质网应激可以诱导细胞自噬的发生，而且Ding等[16]通过不同的内质网应激诱导剂作用于肿瘤细胞和正常细胞，结果表明，对于正常细胞，内质网应激诱导的自噬会导致细胞死亡，进而引起细胞数量的减少。因此本研究基于前期的研究基础，进一步探索柴胡疏肝散对细胞自噬的抑制作用是否通过抑制FD大鼠胃窦组织内质网应激实现的。

在祖国传统医学中无FD这一病名，但根据其临床特点，将其归属于“胃腕痛”“痞证”“嘈杂”“反胃”等范畴。中医学认为，肝主疏泄，具有调畅气机，助脾胃运化、条达情志等功能。肝疏泄正常，气机调畅，脾胃才能发挥升降之枢纽作用；相反，肝疏泄不及，肝气郁结，必将横逆犯胃，从而使胃失和降。在FD的中医分型中，肝郁气滞是最常见的一型，疏肝理气是其主要的治法[15]。柴胡疏肝散作为疏肝理气的代表方剂，对FD具有良好疗效。既往关于柴胡疏肝散治疗FD的机制多从调节胃泌素、生长抑素、5-羟色胺等脑肠肽对胃肠道的调控着手。本研究直接从胃肠道这一主体出发，在组织细胞层面做进一步探索。采用制备肝郁气滞模型最常用的夹尾刺激法制备FD大鼠模型，在造模过程中大鼠出现食欲下降、精神萎靡、体质量减轻、粪便稀软、扎推易怒等外在表现。研究结果显示，模型组大鼠胃排空率低于正常组，并且FD大鼠的胃组织病理切片结果排除了器质性病变，提示FD造模成功。与模型组比较，柴胡疏肝散组、多潘立酮组胃排空率均提高(P均<0.05)，表明柴胡疏肝散对FD大鼠胃排空具有促进作用。

内质网是细胞内负责蛋白折叠、成熟和转运的最主要的细胞器。更重要的是有研究表明内质网是感应微妙环境变化、细胞压力、协调信号通路、调控细胞功能及细胞存活的重要细胞器之一[16]。许多生理病理情况下，如蛋白过度突变、病毒感染、能量营养缺乏、氧化还原状态的改变都能损伤内质网蛋白折叠功能，从而导致内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的大量聚集，进而产生内质网应激。在真核生物中，细胞为了应对这种压力，启动了一个重要信号反应机制，称作未折叠蛋白反应(UPR)[17]。PERK/eIF2α信号通路就是UPR的一条重要分支，也是内质网应激状态下最先激活的一条重要通路。发生内质网应激时，PERK与内质网膜上的伴侣蛋白BIP分离后通过自身的磷酸化导致eIF2α的磷酸化，进而减少蛋白的合成以帮助内质网恢复正常功能，但是内质网应激持续时间过长或者过度强烈时，PERK/eIF2α信号通路就无法恢复内质网的功能，而是促使细胞走向自噬[18]。Zou等[19]在研究脂多糖诱导HL-1细胞自噬时发现，内质网应激在这一过程中扮演重要角色，而且敲除细胞PERK基因后，细胞中自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达下降，p62表达增加。由此说明PERK/eIF2α信号通路的激活在内质网应激诱导自噬的过程中是必要的。因此PERK的激活和p-eIF2α可以看作是内质网应激存在的核心标志物。本研究结果显示，与正常组比较，FD大鼠胃窦组织内PERK和p-eIF2α蛋白表达均升高，提示FD大鼠胃窦组织内存在内质网应激现象。与模型组比较，柴胡疏肝散组FD大鼠胃窦组织内PERK和p-eIF2α表达均降低(P均<0.05)，且较多潘立酮组降低明显(P均<0.05)，表明柴胡疏肝散能抑制FD大鼠胃窦组织内内质网应激PERK/eIF2α信号通路。

综上所述，柴胡疏肝散促进FD大鼠胃排空的作用机制可能与其调控内质网应激信号通路PERK/eIF2α有关。

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ChaihuShuganpowderpromotesgastricemptyingofratswithfunctionaldyspepsia

ZHOUZhou,LINGJianghong,XUKuan,ZHANGLimin,ZHANGYuqin,WANGYujiao,XIETianyi

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

ObjectiveTo observe the promotion of Chaihu Shugan powder on gastric emptying of functional dyspepsia (FD) rats and to investigate the underlying mechanism.MethodsTwenty-four healthy adult SD rats were randomly divided into the normal group, the model group, the Chaihu Shugan powder group, and the domperidone group. The FD rat model was established by tail clamping in all groups except the normal group. All rats were medicated from the first day of modeling, rats in the Chaihu Shugan powder group and domperidone group were treated with 0.63 g/mL Chaihu Shugan powder decoction 1.5 mL and 0.6 mg/mL domperidone suspension 1.5 mL by gavage, respectively, and rats in the normal group and model group were administered normal saline 1.5 mL by gavage, all medications were implemented twice a day and for 4 weeks. At 24 hours after the last medication, all rats were fed with semisolid nutrient paste (1.5 mL/100 g weight) to get the whole stomach by laparotomy with anesthesia after 30 minutes, and then we calculated rates of gastric emptying on the basis of weights of total stomach and empty stomach. The histopathological changes of gastric antrum mucosa were observed by HE staining. The immunohistochemistry (IHC) technique was used to measure the protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α signaling pathway (p-eIF2α) protein expression levels of gastric antrum mucosa tissues in rats.ResultsCompared with the normal group, the rate of gastric emptying in the model group decreased (P<0.05); compared with the model group, the gastric emptying rates of the Chaihu Shugan powder group and domperidone group increased (bothP<0.05). Cells in different tissue layers arranged well. A few lymphocytic and neutrophil infiltrated in antrum of rats in the model group, Chaihu Shugan powder group and domperidone group. Compared with the normal group, the expression of both PERK and p-eIF2α increased in the model group (bothP<0.05); compared with the model group, the expression of PERK and p-eIF2α decreased in the Chaihu Shugan powder group and domperidone group (bothP<0.05).ConclusionChaihu Shugan powder can promote the gastric emptying of FD rats by regulating the endoplasmic reticulum stress signaling pathway PERK/eIF2α.

functional dyspepsia; Chaihu Shugan powder; traditional Chinese medicine; endoplasmic reticulum stress; protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.002

R333.5

A

1002-266X(2017)37-0005-04

国家自然科学基金资助项目(81560763)。

周洲(1990-)，男，在读硕士，主要研究方向为脾胃病的中西医结合诊疗。E-mail:604488606@qq.com

凌江红(1969-)，女，教授，主要研究方向为内科消化系统疾病、脑病的中西医结合诊疗。E-mail：459183870@qq.com

2017-06-24)