针刺“内关”预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及机制研究*

陈 松， 韩永丽， 吴 松△， 王 华， 梁凤霞， 黄 伟，2， 陈 茜

1湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉 430061 2湖北省中医院针灸科，武汉 430061

针刺“内关”预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及机制研究*

陈 松1， 韩永丽1， 吴 松1△， 王 华1， 梁凤霞1， 黄 伟1，2， 陈 茜1

1湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉 4300612湖北省中医院针灸科，武汉 430061

目的探讨电针“内关”预处理是否通过p38 MAPK信号通路来影响心肌缺血再灌注损伤。方法选用3月龄Wistar雄性大鼠40只，体重(220±23) g，编号后按随机数字表分入对照组(仅穿线，不结扎)、模型组、电针预处理组、电针预处理+SB230580组，每组10只。通过阻断左冠状动脉前降支缺血30 min，再灌注120 min，检测心肌缺血再灌注损伤后各项心功能指标(舒张末期压力、左室收缩期平均压、短轴缩短率和射血分数)，检测心肌组织中活性氧(ROS)含量，超氧化物歧化酶SOD活性，丙二醛(MDA)含量及ATP含量，透射电镜下观察心肌超微结构的变化。结果与对照组比较，模型组各项心功能指标中舒张末期压力升高，左室收缩期平均压、短轴缩短率和射血分数均降低(均P<0.05)，梗死面积和梗死程度均升高(均P<0.01)，心肌肌纤维溶解、断裂，间质增大，心肌细胞肿胀明显，SOD活性及ATP含量明显下降，ROS及MDA含量明显上升(均P<0.05)，电针预处理可明显减轻这种变化，差异具有统计学意义(均P<0.05)，SB230580抑制剂可减弱电针“内关”预处理的这种作用(均P<0.05)。结论电针“内关”预处理能显著改善心肌缺血再灌注损伤后心功能及心肌细胞活性，降低心肌梗死面积，减轻线粒体的肿胀程度，保护线粒体的完整性。这种保护作用可能与改善心肌细胞的呼吸功能有关。

电针； 预处理； 缺血再灌注损伤； 线粒体； p38 MAPK通路

与冠状动脉持续闭塞相比，心肌缺血后的及时再灌注能够缩小心肌梗死范围并改善左室收缩功能，而再灌注本身又能导致缺血期间并不存在的损伤并使已有损伤加重。这一过程包含大量交互式机制的级联反应持续进展，最终导致心肌细胞功能代谢紊乱及细胞凋亡[1-2]。这种现象即是心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。MIRI的发生机制非常复杂，常伴随重度的无菌性炎症反应，并通过多重信号通路，诱导炎性细胞因子和炎症趋化因子的产生与聚集。p38 MAPK信号通路作为MAPK家族的重要成员，通过对胞内信号的传递参与细胞对外界环境改变的调节性反应，并且还可以与其他信号通路相互作用，是细胞内信号传递的交汇点[3]。前期研究表明，电针“内关”对缺血心肌细胞电活动有明显的保护作用，其中既有中枢神经核团的参与，也与神经内分泌因子调节下游MAPK信号通路有关[4-8]。但是针刺“内关”预处理降低MIRI损伤，是否有p38 MAPK信号通路的参与，目前鲜见报道。本文旨在探讨针刺“内关”预处理对MIRI的影响及其可能机制，为寻找更好的预处理方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

主要实验仪器：BL-Newcentury 410生物信号及压力测试系统(成都泰盟科技有限公司)，ALC-V系列动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技公司)，aquaplus2系列艾科浦超纯水制成机(美国艾科浦国际有限公司)，WH-2型微型漩涡混匀器(上海沪西分析仪器厂)，Clark氧电极(英国Hansateach公司中国总部)，ST-360型酶标仪(上海旦鼎国际贸易有限公司)，601型超级恒温水浴(江苏省金坛市医疗仪器厂)，TGL-10B系列台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，HANS-200型电针治疗仪(南京济生医疗科技有限公司)。主要试剂：PBS缓冲液、ROS测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒和三磷酸腺苷(ATP)含量测试盒均购自南京建成生物工程研究所，p38 MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580购自美国Selleck生物科技有限公司。

1.2 实验动物及分组

1.2.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠40只，3月龄，体重(220±23) g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，实验动物质量合格证号：42000600008926。动物实验在湖北中医药大学科研中心进行，实验动物设施使用证编号：No.00133292。

1.2.2 实验分组及处理方法 采用随机数字表法，将40只大鼠随机分为4组：对照组(S组)、模型组(M组)、电针预处理组(EA组)和电针预处理+SB230580组(EA+SB组)。对照组：常规饲养，不做任何处理；缺血再灌注(模型)组：捆绑1次/d，20 min/次，第8天开胸后缺血20 min，再灌注40 min；电针预处理组和电针预处理+SB230580组：捆绑1次/d，同时进行电针刺操作，20 min/次，共7 d，SB230580采用颈背部皮下注射，0.3 mg/kg·d，共7 d，第8天开胸后缺血20 min，再灌注40 min。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立

方法参见文献[9-10]。采用体内心肌缺血再灌注损伤模型，用3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔内注射进行麻醉，起效后将大鼠置于鼠台上固定，心电图监测。将大鼠颈部湿润剃毛消毒后横行切开皮肤约1 cm，分层暴露气管，于正中第3、4气管软骨环作倒“T”型切口，置入特制气管导管，接呼吸机[呼吸频率50次/min，呼吸功能比1∶1.5，压力20 cmH2O(1 cmH2O=98 Pa)]。分离右侧颈总动脉，将PE-50聚乙烯管插入颈外静脉和颈动脉，用于心功能监测。左侧胸前湿润剃毛消毒后于胸骨第3、4肋间横切口切开皮肤，用止血钳钝性分离各肌层及胸膜并撑开，剪开心包膜，暴露心脏，在心大静脉附件的左心耳下2～3 mm处用2×6带线圆针6-0号医用锦纶单丝线绕过前降支冠状动脉，肺动脉圆锥旁沟出针，心电图监测显示正常时，于丝线上方垫一PE管，打活结造成缺血模型，并采用推管法行左冠状动脉缺血再灌注术。以左室前壁向外膨胀及心电ST段抬高为缺血标志；再灌注时左室前壁缺血区紫色消失，抬高的ST段下降1/2以上，局部可见反应性充血，有炎性水肿和渗出，即缺血再灌注模型复制成功。

1.4 电针预处理方法

参照《实验动物穴位图谱》[11]选取大鼠腧穴。内关位于大鼠前肢内侧、离腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间，双侧取穴。用0.30 mm×15 mm华佗牌毫针直刺，针刺深度约5 mm，接HANS-200型电针治疗仪，选用连续波，频率2 Hz，强度1 mA，通电治疗20 min。

1.5 指标检测

1.5.1 心肌标本梗死面积和梗死重量的测定 剖取大鼠全心，冰生理盐水洗净，滤纸吸干，液氮固定，浸入新鲜配制的NB-T磷酸缓冲液中染色。染色完全后取出，正常组织(缺血危险区)染色呈蓝色，梗死组织(即梗死区)不染色，呈白色。用数码相机记录心肌标本，采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统分析，分别计算梗死面积占心肌切片总面积的百分比和梗死区占全心重量的百分比。

1.5.2 心功能的测定 造模成功后将已经插入颈动脉的PE-50聚乙烯管末端与生物信号及压力测试系统相连，进入左心室，收集左心室的心功能指标：左室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室收缩期平均压(left ventricular systolic mean presure，LVSP)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)和射血分数(ejection fraction，EF)。

1.5.3 心肌组织内ROS含量、SOD活性、MDA含量及ATP含量测定 在冰槽内切取心脏，并称取100 mg心肌组织放入离心管。制备成10%的匀浆液。将离心管放置于高温沸水浴箱中，10 min后取出摇匀，转速为3 500 g的离心机中离心10 min，抽取上清液检测。之后严格按照试剂盒说明书步骤操作，采用黄嘌呤氧化法检测心肌SOD活性，硫代巴比妥酸法检测心肌MDA含量，高效液相色谱法检测心肌组织中ATP的含量。

1.5.4 心肌组织超微结构观察 取大鼠心脏，滤纸吸干血迹，用4%多聚甲醛固定，再刀片切取心室部位，用2.5%戊二醛固定3 h、磷酸缓冲液漂洗，切片经脱水、包埋、固化、超薄切片，然后以3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，在透射电镜下观察心肌细胞肿胀及损伤程度。

1.6 统计学方法

将实验数据录入IBM-SPSS 19.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差描述，采用K-S或S-W检验以验证数据的正态性，采取Levene检验以验证数据的方差齐性。组间均数差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死情况比较

结果见表1。与S组相比较，M组的梗死面积和梗死程度均升高(均P<0.01)；EA组和EA+SB组的心肌损伤程度均较M组有显著性差异(均P<0.01)，且EA组的各项指标优于EA+SB组(均P<0.05)。

与M组比较，△△P<0.01；与EA组比较，*P<0.05

2.2 各组大鼠心功能比较

结果见表2。与S组相比较，M组、EA组和EA+SB组的LVEDP升高，LVSP、FS、EF均降低(均P<0.05)。同时，EA组、EA+SB组与M组之间各项指标的差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.3 大鼠心肌组织ROS含量、SOD活性、MDA含量及ATP含量

如表3所示，与S组比较，M组、EA组及EA+SB组大鼠心肌细胞SOD活性及ATP含量明显下降，ROS及MDA含量明显上升(均P<0.05);EA组及EA+SB组ROS、MDA、ATP含量及SOD活性，与M组比较，均有显著性差异(均P<0.05)，其中EA组各项指标优于EA+SB组(均P<0.05)。

表2 各组大鼠心功能指标Table 2 The indexes of rat cardiac function in each group(±s)

与S组比较，#P<0.01；与M组比较，△P<0.05

2.4 透射电镜观察各组大鼠心肌细胞内部结构

如图1所示，S组正常心肌纤维排列规则，细胞结构完整，细胞核及线粒体形态和数量正常，线粒体嵴清晰，心肌间未见异常(图1A)。M组(图1B)心肌肌纤维出现溶解断裂甚至坏死，间质增大，肿胀明显；部分线粒体固缩变小，部分线粒体肿胀或外膜破损；线粒体嵴不规则、断裂成絮状、缺失。EA组(图1C)及EA+SB组(图1D)心肌肌纤维间隙轻度增宽，坏死灶减轻，心肌细胞轻微肿胀，细胞核及线粒体结构基本完整，小部分线粒体仍存在空泡样病变。

表3 大鼠心肌组织ROS含量、SOD活性、MDA含量及ATP含量Table 3 The ROS content，SOD activity，MDA content and ATP content in myocardial tissues in each group(±s)

与S组比较，#P<0.01；与M组比较，△P<0.05；与EA组比较，*P<0.05

A：S组；B：M组；C：EA组；D：EA+SB组图1 各组大鼠心肌细胞电镜照片(×10 000)Fig.1 Electronic microscopy of rat myocardiocytes in each group(×10 000)

3 讨论

预处理，即“未病先防”，属于中医学里“治未病”的理论范畴。“治未病”是中医学的重要组成部分，并且有着悠久的文化内涵。如《道德经·七十一章》中说：“其安易持，其未兆易谋，其脆易泮，其微易散，为之于未有，治之于未乱”。《素问·刺热论》中也说：“病虽未发，见赤色者刺之，名曰治未病。”。我国现行卫生医疗服务体系主要包括由各级医院构成的治病体系和疾病预防控制中心构成的防病体系两部分组成，但是防病体系多重视传染病的预防和公共卫生的治理，对常见慢性病及病前亚健康状态关注度不够。在中医防治一体的基本法则和健康理念下，针刺作为一项基本的中医治疗技术，在疾病的预防和康复领域，正受到越来越多的重视[12-14]。并且这种预处理的思想，将可与基因检测手段相融合，做到有针对性地精准预防及治疗[15]。本实验中发现，针刺预处理确实能够改善MIRI的心功能各项指标，降低心肌梗死程度，并且从信号通路水平证实了“未病先防”的合理性。

我们在前期研究中[4-5]，已经证实针刺“内关”穴可以通过p38 MAPK信号通路，抑制心肌细胞中TNF-α和IL-1β的表达，来保护心肌肥厚。并且针刺预处理可以有效保护缺血心肌，启动机体内源性的自我保护机制，抵抗随后可能发生的疾病损害。如针刺“内关”穴预处理能降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图的STⅡ值，减少血浆中降钙素基因相关肽、血清缺血修饰白蛋白含量，提高心肌细胞中缝隙蛋白Cx43的表达水平，参与缺血心肌的保护[16-18]。

活性氧(ROS)，在缺血再灌注时的破坏机制中发挥重要作用。在呼吸爆发状态下，激活的中性粒细胞生成大量ROS，与ROS自身形成的“ROS触发ROS”的大规模爆发。脂质过氧化导致细胞膜损伤及钙超载，通透性增加，诱导细胞毒性的发生，导致自由基清除酶(SOD)的数量和活性降低，MDA、LDH等酶大量漏出，损害心肌细胞[19]。本实验中发现，针刺预处理确实可以改善MIRI心肌细胞的活性和供能，抑制ROS的活性和MDA的生成。同时，ROS作为信号分子，可以介导如蛋白激酶C、MAPKs等信号通路的转导，甚至直接激活p38 MAPK信号通路[20]。p38 MAPK采用高度保守的三级酶促级联反应来进行信号传递，该通路可被多种应激刺激(如热休克、高渗、缺血再灌注等)激活。作为经典的炎症通路，进一步加重MIRI损伤，并且磷酸化p38 MAPK能够进一步活化下游底物，通过核因子介导，启动炎症细胞释放肿瘤坏死因子和白介素等致炎因子，最终导致细胞凋亡[21-22]。本研究也证实了针刺“内关”预处理对心肌的保护作用可能跟调控心肌细胞呼吸功能有关，说明电针“内关”预处理对MIRI心肌损伤的保护作用应该是多种途径共同作用的结果。

电镜下观察到，M组的心肌肌纤维出现溶解断裂甚至坏死，间隙增大，细胞及线粒体肿胀明显。部分线粒体固缩变小，部分线粒体肿胀、或外膜破损。线粒体嵴不规则、断裂成絮状、缺失。EA组和EA+SB组均可以减轻MIRI心肌损伤，有效保护线粒体的完整性。

综上所述，我们通过建立MIRI模型证实，电针“内关”预处理至少可以通过调控心肌细胞呼吸功能有效保护MIRI心肌损伤，也证实了电针对心肌的保护作用应该是多层次，多靶点。但其是否通过p38 MAPK信号通路进行调控，以及如何调控下游转录因子及与哪些功能性基因相关，还需体内、体外实验进一步证实。

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ElectroacupuncturePreconditioningat“Neiguan”PreventsMyocardialIschemia-reperfusionInjuryinRatsbyActivatingp38-MAPKPathway

Chen Song，Han Yongli，Wu Song△et al

CollegeofAcupuncture-MoxibustionandOrthpaedics，HubeiUniversityofChineseMedicine；HubeiCollaborativeInnovationCenterofAcupunctureandMoxibustionforDiseasePrevention，Wuhan430061，China

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of electroacupuncture preconditioning at “Neiguan” in preventing myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI)in rats.MethodsForty male Wistar rats，3 months old，weighting about (220±23) g，were randomly divided into four groups：sham operation group(sham group)，MIRI model group(model group)，electroacupuncture preconditioning group(EA group)and electroacupuncture preconditioning+SB203580 group(EA+SB group)，with 10 rats in each group.The MIRI model was achieved by the ligation of the left anterior descending artery to cause ischemia for 30 min and then deligation for 120-min reperfusion.Before the model establishment，rats in the EA group and EA+SB group

electric acupuncture for 20 min(1 mA，continuous wave).After MIRI，the cardiac function indexes including left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)，left ventricular systolic mean pressure(LVSP)，fractional shortening(FS)and ejection fraction(EF)were evaluated.Myocardial tissues were later obtained，the contents of ROS，SOD，MDA and ATP were detected and the ultrastructures were observed.ResultsRats in the model group had increased infarction size when compared with those in the sham group.Their LVSP，FS and EF were much lower，and LVEDP much higher than those in the sham group(P<0.05).There were dissolved and necrotic muscle fibers，increased myocardial interstitial gap and edema in the model group.The contents of ROS and MDA were increased，and those of ATP and SOD activity decreased in the model group as compared with those in the sham group(P<0.05).These indexes were greatly improved in rats experiencing electroacupuncture preconditioning，whereas the effects were suppressed after addition of SB230580(P<0.05).ConclusionElectroacupuncture preconditioning at“Neiguan” significantly improves the cardiac function，increases the cell activity，decreases the infarction area，mitigates the mitochondrial swelling and protects the integrity of the mitochondria，which may be associated with the improvement of the respiratory function of myocardiocytes.

electroacupuncture； preconditioning； myocardial ischemia-reperfusion injury； mitochondrion； p38 MAPK signaling pathway

*国家自然科学基金青年基金资助项目(No.81403460)

陈 松，男，1986年生，讲师，E-mail：362573836@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：119065124@qq.com

R245.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.006

(2016-08-15 收稿)