响应面曲线法优化豆葆茶饮用冲泡条件及其抗氧化能力研究

陶阿丽,尹伟,施苗苗,孟博

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

响应面曲线法优化豆葆茶饮用冲泡条件及其抗氧化能力研究

陶阿丽,尹伟,施苗苗,孟博

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

以绿原酸的提取率为指标，采用响应面曲线法对古方豆葆茶的饮用冲泡条件进行了优化，并对其抗氧化能力进行了研究。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken实验分别分析各因素之间的交互作用和显著性，以获得豆葆茶最佳饮用冲泡工艺。结果显示，豆葆茶最佳饮用冲泡条件是：冲泡时间20min，加水量23mL/g，冲泡温度90℃，该条件下豆葆茶有效活性成分绿原酸的提取率达到最大，为2.219%。豆葆茶水提物对羟基自由基和超氧阴离子的清除率测定结果显示其具良好的体外抗氧化活性。

豆葆茶；绿原酸；冲泡；响应面曲线法；抗氧化

豆葆茶主要由金银花、薄荷以及蒲公英3种天然草本为主要原料配制而成的古方茶饮，在中国古老茶疗文化中占有很重要的作用，具有清心、明目、抗炎、消肿等作用。绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)富含于金银花、蒲公英中，是豆葆茶重要的生物活性成分。绿原酸又名咖啡鞣酸，是咖啡酸与奎尼酸的缩酚酸[1]，其主要的功效有抗菌[2]、抗病毒[3,4]、抗癌[5]、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤[6～9]和降血压并保护心血管的作用。为了充分发挥豆葆茶的茶疗作用，对豆葆茶饮用冲泡条件进行研究具有重要意义。本研究采用响应面曲线法设计试验，以绿原酸提取率为指标，确定古方豆葆茶的最佳饮用冲泡条件。通过考察豆葆茶水提物对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率，获得豆葆茶水提物的体外抗氧化活性，以期为古方豆葆茶的研究及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

豆葆茶为金银花、薄荷、蒲公英按1∶1∶1比例组方，均购于安徽省合肥市安天大药房，经安徽中医药大学刘金旗副教授鉴定；绿原酸对照品购于中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；FeSO4、水杨酸等试剂均为分析纯。

UV-4802S 型紫外可见分光光度仪为尤尼柯(上海) )仪器有限公司产品；DZF-6020 型真空干燥箱为上海三发科学仪器有限公司产品；HH数显恒温水浴锅为江苏金坛市金城国胜实验仪器厂产品；FA2004 型电子天平为上海民桥精密科学仪器有限公司产品。

1.2方法

1.2.1绿原酸标准曲线绘制

图1 绿原酸标准曲线

精密称定绿原酸对照品0.0036g，于100mL容量瓶中用蒸馏水定容，即得浓度为36μg/mL的绿原酸标准溶液。分别吸取一定量标准溶液置于10mL容量瓶中定容至刻度，获得0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg /mL的待测溶液[10]。在波长326nm处测定各浓度溶液的光密度。以溶液浓度C为横坐标、光密度D为纵坐标绘制标准曲线(图1)，得回归方程为D=0.0460C-0.0845，R2=0.9977。

1.2.2豆葆茶绿原酸的提取及含量测定

称取豆葆茶1g，置于100mL烧杯中，加入一定量的蒸馏水，在一定温度下水浴加热一定的时间，抽滤得绿原酸提取液，滤液稀释一定比例后在波长326nm处测得光密度[11]，根据回归方程换算绿原酸提取的浓度，进而计算其提取率。

式中：Y为绿原酸提取浓度，mg/mL；V为反应体积，mL；M为提取物的质量，g。

1.2.3试验设计

根据预试验结果，以豆葆茶中绿原酸的提取率为指标，分别选择冲泡时间、加水量和冲泡温度为影响因素进行单因素试验。再根据单因素试验的结果，应用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计，选取冲泡时间(A)、加水量(B)、冲泡温度(C)为考察因素，各因素设置3水平。根据响应面试验结果，确定豆葆茶最佳饮用冲泡条件。

1.2.4豆葆茶水提物抗氧化试验

1)羟基自由基清除试验 采用Fenton反应[11]，将6mmol/L FeSO4溶液2.0mL和6mmol/L 水杨酸溶液2.0mL混合，再加入不同浓度的豆葆茶水提取液和维生素C各2.00mL，最后加入6mmol/L的H2O2溶液2mL，启动反应，随后静置10min。以相同体积蒸馏水代替H2O2为空白对照，在波长510nm处测定光密度。每个样品进行 3 次平行试验，结果取平均值。根据以下公式计算其清除率：

式中：D0为空白管光密度；Di为样品管光密度。

2)超氧阴离子清除试验 根据邻苯三酚法[12]稍加改进。取浓度为0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5mL，在20℃水浴中加热20min后，分别加入不同浓度的豆葆茶水提取液1.0mL和浓度为25mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL，摇匀，在25℃水浴中反应5min。随后，加入8mol/L的盐酸溶液1mL，终止反应。在波长299nm处测定溶液光密度。根据以下公式计算其清除率：

式中：D0为空白管光密度；Di为样品管光密度。

2 结果与分析

2.1冲泡时间对豆葆茶绿原酸提取率的影响

称取5份各1g的豆葆茶，分别加入蒸馏水15mL，在50℃水浴加热5、10、15、20、25min，抽滤得绿原酸提取液，取1mL稀释100倍，在326nm波长处测定光密度并计算提取率。由图2可知，随着冲泡时间的增加，绿原酸提取率不断增加，到15min左右到达最大值，随后提取率不再增大。因此，在其他条件确定时，最佳冲泡时间为15min。

2.2加水量对豆葆茶绿原酸提取率的影响

图2 不同冲泡时间的绿原酸提取率

称取5份各1g的豆葆茶，分别加入蒸馏水10、15、20、25、30mL，在50℃水浴加热15min，抽滤得绿原酸提取液，取1mL稀释100倍，在326nm波长处测5份不同浓度绿原酸提取液的光密度，根据标准曲线回归方程计算绿原酸提取率。由图3可知，加水量达到20mL左右时达最大绿原酸提取率。随着加水量的增加，绿原酸提取率稍减少，但变化不明显。因此，豆葆茶冲泡时的最佳加水量为20mL左右。

2.3冲泡温度对豆葆茶绿原酸提取率的影响

称取5份各1g的豆葆茶，分别加入蒸馏水20mL，分别在50、60、70、80、90℃水浴加热15min，抽滤得绿原酸提取液，取1mL稀释100倍，在326nm波长处测5份提取液的光密度，根据标准曲线计算提取率。由图4可知，随着冲泡温度的升高，绿原酸提取率在不断增加，当达到80℃有最大的提取率，之后随冲泡温度的升高，绿原酸的提取率下降。因此，在其他条件确定时，豆葆茶的最佳冲泡温度是80℃。

图3 不同加水量的绿原酸提取率 图4 不同冲泡温度的绿原酸提取率

2.4响应面法优化豆葆茶饮用冲泡条件

根据单因素试验结果，选择冲泡时间、加水量、冲泡温度为影响因素，利用Design-Expert8.0.6软件，根据Box-Behnken中心组合设计试验[13]，因素水平设计详见表1，响应面试验设计及结果见表2。对试验所得的数据进行多次拟合，得到豆葆茶绿原酸提取率方程为：

Y=2.16-0.01A+0.14B+0.053C+0.027AB+0.048AC-0.012BC-0.022A2-0.14B2-0.047C2

式中：Y为提取率；A为冲泡时间；B为加水量；C为冲泡温度。

表1 因素水平

表2 Box-Behnken设计及绿原酸提取试验结果

回归方程显著性检验及方差分析结果见表3。

表3 模型与方差

图5 冲泡时间和加水量对提取率的影响

应用响应面分析法对试验结果和数学模型进行分析，结果显示，回归模型呈现出高度显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.6276>0.05)，可知回归方程的拟合度和可信度均较高，能够很好预测各条件下豆葆茶中绿原酸的提取率。

通过响应面图(图5、图6、图7)，可以直观地观察各影响因素之间的相互关系。由图5所示，当加水量达到23mL左右、冲泡时间20min左右，绿原酸的提取率达到最大值。由图6所示，当提取时间为20min左右、温度89℃左右提取率达到最大值，之后在最大值附近波动。由图7所示，出当加水量达到23mL左右和温度为89℃左右时，绿原酸的提取率达到最大值。对拟合方程进行优化，即得模型最大值，即冲泡时间为20.00min、加水量为22.69mL、冲泡温度为89.96℃。在该工艺条件下，预测绿原酸的最大提取率可达2.219%。考虑到实际操作的可行性，需对二次回归所得到的最佳条件修正拟合。最后，确定最佳冲泡条件为：冲泡时间为20min、加水量为23mL、冲泡温度为90℃。为了验证该提取工艺的可行性，重复最佳冲泡条件3次，获得绿原酸提取率的平均值为2.25%。结果与二项式拟合方程预测的最大值进行比较，平均偏差为1.40%，显示该模型有效。

2.5不同浓度豆葆茶水提物对·OH的清除能力

不同浓度豆葆茶水提物对·OH的清除率试验结果如图8所示。结果显示，豆葆茶水提物对·OH的清除能力强于相同浓度的维生素C(P<0.05)。同时随着浓度的增加，豆葆茶水提物对·OH的清除能力逐步增强。

图6 冲泡时间和冲泡温度对提取率的影响图7 加水量和冲泡温度对提取率的影响

2.6不同浓度豆葆茶水提物对超氧阴离子的清除能力

图8 不同浓度豆葆茶水提物对·OH的清除率 图9 不同浓度豆葆茶水提物对O-2·的清除率

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应曲线法进行试验设计，以豆葆茶中绿原酸提取率为响应指标，优选出豆葆茶的最佳冲泡工艺。同时，采用羟基自由基、超氧阴离子2种体外抗氧化模型，考察了豆葆茶提取物的体外抗氧化能力。单因素试验结果显示，冲泡时间、加水量、冲泡温度对绿原酸的提取率均有影响。采用响应面曲线法优选豆葆茶的最佳冲泡饮用工艺条件，结果显示，豆葆茶的最佳冲泡饮用条件为:冲泡时间为20min，加水量为23mL/g，冲泡温度为90℃。在此最佳冲泡条件下，豆葆茶中绿原酸的提取率的最大值为2.25%。因此，在饮用豆葆茶时，需要在90℃热水中按1︰23的比例浸泡约20min，此时绿原酸的提取率达到最大，使豆葆茶清热解毒药用效果最好。同时，豆葆茶的水提取物对羟基自由基、超氧阴离子均具较明显的清除作用，羟基自由基清除率强于维生素C，超氧阴离子清除率弱于维生素C，但都与其浓度存在着明显的量效关系。

[1]吴卫华,康桢,欧阳冬生,等.绿原酸的药理学研究进展[J].天然产物研究与开发,2006,(18):691～694.

[2]孙莉莉,顾蔚华,惠芳.抗病毒颗粒的质量标准研究—绿原酸含量测定[J].抗感染药学,2006,3(4):154～l55.

[3]向福,刘亮,秦婷,等.罗田金银花叶中绿原酸的提取工艺改进[J].食品与机械,2013,29(6):150～152.

[4]Chiang L C,Chiang W,Chang M Y,etal.Antiviral activity of plantago major extracts and related compoundsinvitro[J].Antiviral Res,2002,55:53～62.

[5]Jiang Y,Kusama K,Satoh K,etal.Induction of cytotoxicity by chlorogenic acid in human oral tumor cell lines[J].Phy-comedicine,2000,7:483～491.

[6]Rodriguez de Sotillo D V,Hadley M.Chlorogenic acid modifies plasma and liver concentrations of Cholesterol,and minerals in Zucker rats[J].Nutr Biochem,2002,13:717～726.

[7]杜延兵,裘爱泳.绿原酸生物活性、资源及其提取纯化[J].现代食品科技,2006,22(2):250～252.

[8]蔚芹,景谦平,马希汉.杜仲叶中绿原酸的提取工艺条件研究[J].林产业化学与工业,2001,21(14):27～32.

[9]Frank J,Kamal-EIdin A,Razakan A,etal.The dietary hydroxycinnamate caffeic acid and Its conjugate cholrogenic acid increase vitamin E and cholesterol concentrations in Sprague Dawley rats[J].Agric Food chem,2003,51:2526～2531.

[10]乌兰,张泽生.金银花中绿原酸的提取及检测[J].食品科学,2005,26(6):131～132.

[11]孟醒,李安平,余江帆,等.平卧菊三七提取物体外抗氧化活性研究[J].食品与机械,2016,32 (10):145～150.

[12]李文娜,肖苑,陈阳,等.杜仲叶绿原酸提取物与绿原酸、维生素体外抗氧化比较[J].食品工业科技,2012,33 (11):137～140.

[13]侯学敏,李林霞,张直峰,等.响应面法优化薄荷叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J].食品科学,2013,34 (6):124～128.

2017-04-07

安徽省教育厅高校优秀青年人才支持计划重点项目(gxyqZD2016395)；安徽省教育厅质量工程项目(2016mooc194)；国家级大学生创新训练项目(201612216011)；安徽省大学生创新训练项目(201612216091)；安徽新华学院校级科研团队项目(2016td016)。

陶阿丽(1983-)，女，副教授，主要从事基础化学与天然产物开发研究，taoali84 @163.com。

[引著格式]陶阿丽,尹伟,施苗苗,等.响应面曲线法优化豆葆茶饮用冲泡条件及其抗氧化能力研究J.长江大学学报(自科版) ，2017，14(18)：65～70.

TS272.5

A

1673-1409(2017)18-0065-06

[编辑] 余文斌