骨质疏松肾阳虚和肾阴虚证型下左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路的研究

章建华　邢婧　范连霞　尹华

[摘要]該文研究骨质疏松（OP）肾阳虚和肾阴虚证型下左归丸含药血清对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）表达及对成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关因子βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA及蛋白表达的作用。采用手术去卵巢法造成大鼠骨质疏松模型，并在手术10周后，分别注射氢化可的松、灌胃甲状腺素造成大鼠OP肾阳虚及OP肾阴虚模型；用新生24 h乳鼠颅骨体外培养得成骨细胞，以碱性磷酸酶和茜素红染色进行鉴定，分别用OP肾阳虚、OP肾阴虚及OP组（对照组）所得的左归丸含药血清、空白血清干预成骨细胞，采用MTS法检测细胞增殖情况，ELISA法检测ALP表达，RTPCR法检测ERK1/2，βcatenin mRNA的表达，Western blot法检测ERK1/2，βcatenin蛋白表达。结果表明：OP肾阴虚证型下左归丸含药血清在促进成骨细胞增殖、ALP表达、成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关因子βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA及蛋白表达方面比OP肾阳虚证型下左归丸含药血清的作用更强。这与“左归丸滋肾阴”的中医理论相吻合，为临床辩证治疗骨质疏松症提供科学依据。左归丸通过ERK1/2和Wnt/βcatenin信号通路调控成骨细胞的增殖与分化，可能是左归丸防治骨质疏松肾阴虚证的机制之一。

[关键词]左归丸； 成骨细胞； 含药血清； 骨质疏松肾阳虚； 骨质疏松肾阴虚； Wnt/βcatenin信号通路； ERK1/2信号通路

[Abstract]To clarify the effects of Zuoguiwan containing serum on osteoblast proliferation and alkaline phosphatase（ALP） expression and its effects on the expression of βcatenin， ERK1， ERK2 mRNA and protein of osteoblast through ERK1/2， Wnt/βcatenin signaling pathway in models with osteoporosis（OP） kidneyYangdeficiency， osteoporosis（OP） kidneyYindeficiency syndrome Rat osteoporosis models were established by ovariectomy surgery， and 10 weeks after surgery， hydrocortisone was injected and thyroxine was administered by intragastric administration to establish OP kidneyYangdeficiency rat model， and OP kidneyYindeficiency rat model Osteoblasts were obtained from 24 h newborn rat skull and were identified by alkaline phosphatase and alizarin red staining Zuoguiwan containing serum of OP， OP kidneyYangdeficiency， and OP kidneyYindeficiency， as well as the blank serum were used to intervene the osteoblast， and the cells proliferation was detected by MTS ELISA assay was used to detect ALP expression RTPCR assay was used to detect the mRNA expression of ERK1， ERK2， βcatenin and protein expression levels were detected by Western blot The results showed that Zuoguiwan containing serum in OP kidneyYindeficiency model had stronger effect than OP kidneyYangdeficiency in promoting osteoblast proliferation， ALP expression， osteoblast ERK1/2， Wnt/βcatenin signaling pathway related factors βcatenin， ERK1， ERK2 mRNA and protein expression levels This was consistent with the TCM theory of "Zuoguiwan nourishes kidney Yin"， providing a scientific basis for the clinical and dialectical treatment of osteoporosis Zuoguiwan could regulate the proliferation and differentiation of bone cells by ERK1/2 and Wnt/βcatenin signaling pathway， which may be one of the mechanisms of Zuoguiwan for the prevention of osteoporosis.

[Key words]Zuoguiwan； osteoblasts； drug containing serum； OP kidneyYangdeficiency； OP kidneyYindeficiency； Wnt/βcatenin signaling pathway； ERK1/2 signaling pathwayendprint

骨质疏松症（OP）是机体自然衰老、退化过程的表现，以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，骨皮质多孔、变薄为特征，并由此导致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身性骨代谢性疾病。随着社会人口老龄化的日趋严重，骨质疏松症已成为常见病。中医学将骨质疏松归属于“骨痹”[1]，认为肾虚是本病的主要病机[28]，故中医药治疗骨质疏松症多从补肾入手，实验室与临床研究结果均显示该治疗主方向的有效性[3，912]。根据个体的体征差异，主要有肾阳虚和肾阴虚2种证候。补肾名方左归丸，始载于明朝张介宾所著《景岳全书》中，方中熟地黄、枸杞、菟丝子、山茱萸、山药、鹿角胶、龟板胶、牛膝共用，具有滋补肾阴的功效。基于中医理论辨证论治的思想，本课题借助骨质疏松肾阳、肾阴虚证型制备左归丸的含药血清与空白血清，分别干预成骨细胞，通过检测细胞增殖情况、ALP表达情况以及与ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关的各因子mRNA及蛋白表达情况，研究骨质疏松肾阳、肾阴虚证候下左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路作用的差异，从而阐释左归丸“辨证”治疗骨质疏松症的作用机制和理论基础。

1材料

11动物清洁级SD大鼠，雌性，体质量（200±20） g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（沪）20080016，用于骨质疏松不同证型的制备及含药血清的制备；新生24 h内乳鼠，用于成骨细胞的分离培养。

12试药与试剂熟地黄（130807，产地：河南）、山药（140226，产地：浙江）、枸杞（140211，产地：宁夏）、山茱萸（131115，产地：浙江）、牛膝（141225，产地：四川）、菟丝子（141204，产地：辽宁）、肉桂（131226，产地：广西）、鹿角胶（20120103，产地：河南）、龟板胶（20120103，产地：河南），均购自华东医药股份有限公司药材参茸分公司，经浙江中医药大学张如松教授鉴定为正品。

Ⅰ型胶原酶（Gibco分装）；DMEM高糖型培养液（Hyclone）；胎牛血清（Gibco，USA）；025%胰酶EDTA（Sigma，USA）；001 mol·L-1PBS（吉诺生物医药技术有限公司）；红细胞裂解液（碧云天生物科技）；碱性磷酸酶染液（南京建成生物工程研究所）；茜素红（Sigma，USA）；MTS（Promaga，0000094244）； RIPA裂解液（批号00011401，康为生物）；蛋白酶抑制剂混合物（WBP1265，达文生物）；ALP含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白定量试剂盒（00061311，康为世纪）；甘氨酸（amresco，9978c366）；十二烷基硫酸钠（SDS）（amresco2227）；AP（amresco0496）；TEMED（上海远慕科技）； Trisbase （amresco0497）；TBST缓冲液（上海樊克生物）； 15 mol·L-1 TrisCl （pH 88），10 mol·L-1TrisCl（pH 68）（碧云天生物科技）；5×SDS上样缓冲液、预染marker（康为世纪）；PVDF膜（K4AA7969，Immobilon）；1×TAE电泳缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖、6×加样缓冲液、细胞总RNA提取试剂盒（杭州宝赛生物，RE02050）；Dnase I（Promega，M6101）；反转录试剂盒（杭州宝赛，RT02020）；荧光定量试剂盒（杭州宝赛，PM10003）。Western blot所需抗体见表1。

13左归丸药液的制备按处方量称取各味药材，左归丸：熟地黄24 g、山药12 g、枸杞12 g、山茱萸12 g、牛膝9 g、菟丝子12 g、龟甲胶12 g、鹿角胶12 g，分别加入10倍量50%乙醇，室温下浸泡1 h，45 ℃条件下超声提取30 min，2次，合并药液，过滤，减压浓缩至生药4 g·mL-1，4 ℃保存备用。

14仪器Sartorius BS110S 1/1万电子天平（德国塞多利斯公司）；Heidolph 5804R超速冷冻离心机（德国海道夫公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SENCO R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；CO2培养箱（德国赛默飞世尔科技有限公司）；超净工作台（苏州苏净公司）；多功能酶标分析仪（德国赛默飞世尔科技有限公司）；旋转式恒温振荡仪（江苏培英公司）；Odyssey双波长成像系统（Licor，美国）；电泳仪（BioRad，美国）；定量PCR仪（安捷伦，Agilent Stratagene Mx3005P）；微量离心机（美国AndyBio公司，AndyBio Mcentrifuge）。

2方法

21动物模型的建立与评价取SD雌性大鼠，分成正常组与模型组，正常组行假手术，切除卵巢附近一小块脂肪，模型组切除双侧卵巢造成骨质疏松模型。将模型组分成OP组、OP肾阴虚组、OP肾阳虚组。OP肾陽虚组于术后10周开始，每日臀部肌肉注射氢化可的松，剂量为0025 mg·g-1，连续10 d；OP肾阴虚组于术后第10周开始，每日灌胃给予甲状腺素，剂量为016 mg·g-1，连续10 d。造模期间观察记录OP组、OP肾阴虚组、OP肾阳虚组动物的一般行为状态、体质量、肛温，并且测定血清cAMP和cGMP的含量。由于OP模型的建立方法较为经典，故OP模型的确定依据为病理切片及骨密度检测，病理切片结果见图1。

22新生24 h乳鼠颅骨成骨细胞体外培养颈椎脱臼法处死1日龄乳鼠，75%乙醇浸泡消毒15 min。无菌分离出颅盖骨，除去附着的血管及结缔组织，

A正常大鼠股骨；B骨质疏松症大鼠股骨。

PBS 冲洗3次，剪成1 mm3大小的碎块，用PBS清洗3次，加入2 mL的025%胰蛋白酶，于37 ℃水浴中预消化30 min，加入等体积的10%胎牛血清DMEM双抗完全培养基终止消化。弃除消化液，加入浓度为01%Ⅰ型胶原酶5 mL，于37 ℃水浴下，振荡消化1 h，取上清液置于另一个离心管中，1 000 r·min-1离心5 min 后弃上清液，加入适量完全培养基，制成细胞悬液，剩余的骨片中再继续重复振荡消化1次，混匀2次消化的细胞悬液，接种至培养瓶，endprint

于37 ℃，含5%CO2，饱和湿度的培养箱内培养，3 d后换液去除未贴壁细胞。此后每隔3 d 换液1次，直至细胞约80%融合时按1∶3传代，反复纯化，传至第3代进行实验，成骨细胞碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果见图2。

A碱性磷酸酶染色；B茜素红染色。

23骨质疏松、骨质疏松肾阳、肾阴虚证型下左归丸含药血清的制备随机取OP大鼠、OP兼肾阳虚大鼠、OP兼肾阴虚大鼠各20只，随机分为2组，一组灌胃纯水，另一组灌胃左归丸药液。具体方法如下：按照每100 g灌胃15 mL，1 d 2次，连续6次后，于末次给药后1 h，心脏取血。4 ℃静置2 h，于4 ℃，4 000 r·min-1离心25 min，即得，同组血清混合。56 ℃水浴灭活30 min，过膜，储存于-80 ℃冰箱，备用。临用前，将血清用DMEM双抗基础培养基（不含FBS）稀释成各所需浓度。

24不同状态下左归丸含药血清对成骨细胞增殖的影响取生长良好的第3代成骨细胞，以3 000个/孔接种于96孔板中，24 h贴壁后，更换成含2% FBS的DMEM培养液饥饿培养，使细胞同步化；24 h后，更换成各组左归丸含药血清与空白血清。每组设置6个复孔，继续培养72 h后，吸弃旧的培养液，PBS冲洗2次，并于每孔中加入100 μL基础培养液（不含FBS），再加入20 μL MTS，于37 ℃，5%CO2，饱和湿度细胞培养箱中继续避光培养2 h，酶标仪上490 nm测定吸光度（A）。

25不同证型左归丸含药血清对成骨细胞ALP表达的影响取第3代成骨细胞，以5万个/孔接种于24孔板中，24 h贴壁后，更换成含2%FBS的培养液饥饿24 h，分别加入各种证候下的左归丸含药血清与空白血清，每组设6孔。72 h后，吸取细胞培养上清液，4 ℃，1 500 r·min-1离心20 min，取上清，用碱性磷酸酶试剂盒测定碱性磷酸酶表达情况。

26RTPCR法检测成骨细胞βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA表达取第3代成骨细胞，以5万个/孔接种于24孔板中按25项下方法进行干预，每组3瓶。72 h后，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA。用RTPCR试剂盒采用二步法将其逆转录成cDNA，以不同引物进行RTPCR，检测样品中ERK1，ERK2，βcatenin基因mRNA表达情况，以βactin作为内参基因，引物序列见表2。

27Western blot法测定成骨细胞βcatenin，ERK1，ERK2蛋白表达取第3代成骨细胞，以1×106个/瓶的密度接种于25 cm2细胞培养瓶中，按25项下方法进行干预，每组3瓶。72 h后，胰酶消化下细胞，移至15 mL离心管。每瓶细胞加250～500 μL RIPA裂解液，14 000 r·min-1，4 ℃，离心30 min，收获蛋白，测定蛋白浓度。用SDSPAGE电泳

分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，一抗室温振摇孵育2 h，4 ℃过夜，二抗室温振摇孵育2 h。用增强型DAB底物显色试剂盒进行显影，将PVDF膜进行扫描。用蛋白图像分析软件检测条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

28统计学处理采用SPSS 160统计软件进行数据分析，计量数据以±s表示，t检验进行分析，P<005表示具有统计学意义。

3结果

31不同证型下左归丸含药血清对成骨细胞增殖的影响OP，OP肾阴虚，OP肾阳虚左归丸含药血清与相应状态下的空白血清比较，均能促进成骨细胞增殖，且具有显著性差异（P<005），其中OP肾阴虚左归丸含药血清对成骨细胞增殖的促进作用最强，见表3。

32不同证型下左归丸含药血清对成骨细胞ALP表达的影响OP，OP肾阴虚，OP肾阳虚左归丸含药血清与相应状态下的空白血清比较，均能促进成骨细胞培养上清液中ALP表达，且具有显著性差异（P<005），其中OP肾阴虚左归丸含药血清对成骨细胞培养上清液中ALP表达的促进作用最强，见表4。

33不同证型左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关因子mRNA表达的影响OP，OP肾阴虚，OP肾阳虚左归丸含药血清均能上调βcatenin，ERK2 mRNA的表达，其中OP，OP肾阴虚左归丸含药血清，与相应证型下的空白血清比较，具有显著性差异（P<005）；OP，OP肾阴虚左归丸含药血清能上调ERK2 mRNA的表达，与相应证型下的空白血清比较，具有显著性差异（P<005）；OP肾阳虚左归丸含药血清，与相应证型下的空白血清比较，反而抑制ERK2 mRNA的表达。与OP肾阳虚左归丸含药血清比较，OP肾阴虚左归丸含药血清组能够显著上调βcatenin，ERK1，ERK2 mRNA的表达（P<005）。与OP左归丸含药血清比较，OP肾阴虚左归丸含药血清能够显著上调ERK1，ERK2 mRNA的表达（P<005），但对βcatenin的作用无明显差异，见表5。

34不同证型左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2，Wnt/βcatenin信号通路相关因子蛋白表达的影响OP，OP肾阴虚、OP肾阳虚左归丸含药血清均能上调βcatenin，ERK1，ERK2蛋白的表达，其中OP，OP肾阴虚左归丸含药血清在上调βcatenin蛋白表达方面，与相应证候下的空白血清比较，具有显著性差异（P<005），OP肾阳虚左归丸含药血清在上调ERK2蛋白表达方面，与相应证候下的空白血清比较，具有显著性差异（P<005）。与OP肾阳虚左归丸含药血清比较，OP肾阴虚左归丸含药血清能显著上调βcatenin蛋白的表達（P<005），亦能上调ERK1，ERK2蛋白的表达，但无显著性差异，见表6及图3。

A，B，COP、OP肾阴虚、OP肾阳虚证候下的左归丸含药血清；A1，B1，C1为相应证候下的空白血清。endprint

4讨论

随着对骨质疏松症病因病机认识的发展，已知Wnt，BMP，MAPK和Hedgehog多种信号通路与疾病的形成发展有关。目前研究较多的是经典Wnt信号通路（即Wnt/βcatenin信号通路）和ERK1/2信号通路[1415]。βcatenin由130个氨基酸残基构成，存在于细胞质、细胞膜和细胞核中，且以细胞质中含量最多[16]。βcatenin是经典Wnt信号通路中关键的中枢性因子，调节其在胞内的稳定的积累对通路的激活至关重要。当细胞质内的βcatenin积累到一定量后，进而进入细胞核内，促进基因的转录。βcatenin在成骨细胞中存在广泛的表达，能促进成骨细胞的分化与存活。ERK1/2信号通路是目前研究的最为透彻的促分裂原活化蛋白激酶（MAPKA）通路，它是多数生长因子、细胞因子调控细胞增殖的重要途径[17]。袁晓军等[18]在探讨小鼠成骨细胞暴露于金属钴、铬离子条件下对RANKL表达的影响及ERK信号通路在这一过程中作用，寻找防治假体周围骨溶解的方法的实验中发现金属离子可刺激成骨细胞RANKL mRNA的表达并促进RANKL蛋白的分泌；ERK信号通路抑制剂PD98059可一定程度抑制RANKL的表达，从侧面证实了两者之间的联系。

OP肾阴虚左归丸含药血清对成骨细胞增殖、ALP活性、βcatenin，ERK1，ERK2蛋白及mRNA的表达的促进作用最强。作者认为可能原因如下：左归丸以熟地黄为君药，有研究表明[23]熟地黄中主要有效成分梓醇在较低浓度时可以促进成骨细胞增殖；以山茱萸、山药、枸杞为臣药，亦有研究表明这些中药的有效成分对成骨细胞增殖及ALP活性有一定的促进作用[1921]。作者推测左归丸含药血清是通过以上这些成分发挥对成骨细胞促增殖、促进ALP活性及相关因子蛋白及mRNA表达的作用，且这些成分在OP肾阴虚状态下发挥最佳效果，并且这种作用是通过干預Wnt/βcatenin信号通路和ERK1/2信号而产生的。但目前关于这些成分如梓醇、马钱苷、莫诺苷等抗骨质疏松的体外实验（对成骨细胞作用）和整体研究报道较少，缺少相关对照，还需进一步深入研究。

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[责任编辑张宁宁]endprint