不同中药总黄酮含量测定方法的选择研究

张 敏，李志英

(忻州师范学院 化学系 ，山西 忻州 034000)

不同中药总黄酮含量测定方法的选择研究

张 敏，李志英*

(忻州师范学院 化学系 ，山西 忻州 034000)

微波辅助提取十种中药中的总黄酮，以芦丁为标准品，用五种不同的测定方法探讨不同中草药中总黄酮的含量，研究黄酮结构和测定方法之间的关系.结果表明：直接测定法更适合甘草、银杏叶和陈皮; NaNO2-Al(NO3)3法更适合于山楂和黄芪; 差示分光光度法更适合于野菊花、山楂、葛根和连翘； AlCl3法更适合于陈皮；荧光光度法除山楂外，其它中草药测定均佳.根据总黄酮含量的测定方法的原理探讨不同中药中黄酮类物质的结构.

总黄酮；中草药；测定方法；黄酮结构

黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是目前备受关注的天然活性物质之一.黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性，护肝、解肝毒、抗真菌、治疗急慢性肝炎、肝硬化[1]等作用.总黄酮含量作为中草药质量控制指标，它的测定方法有很多，用不同的方法测定同一种中药的总黄酮的含量也是不相同的.由于，不同的中草药的黄酮结构有所差别，需选择最佳的测定方法，研究黄酮类物质的结构与测定方法的关系具有一定的指导意义.

本文研究比较了紫外直接测定法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法、AlCl3显色法、示差分光光度法、荧光分光光度法对不同中草药中总黄酮含量测定的适用性, 进一步去探究黄酮的结构与测定方法之间的关系，为中草药中总黄酮含量的测定提供理论依据.

1 材料与方法

1.1试剂与材料

野菊花(1号)、山楂(2号)、黄芪(3号)、甘草(4号)、桔梗(5号)、党参(6号)、陈皮(7号)、葛根(8号)、连翘(9号)、银杏叶(10号) (购自忻州市五台山大药房)；芸香叶苷(芦丁)(A.R.北京化学试剂公司)；亚硝酸钠(A.R.天津市福晨化学试剂厂)；硝酸铝(九水)(A.R.天津市光伏精细化工研究所)；氢氧化钠(A.R.天津市申泰化学试剂有限公司)；三氯化铝、醋酸钠、冰乙酸、三乙醇胺、无水乙醇、95%乙醇(A.R.天津市风船化学试剂科技有限公司).

电子天平(AL104,梅特勒-托利多仪器有限公司)；高速中药粉碎机(FW135，武义县屹立工具有限公司)；微波炉(LWMC-201，南京凌江科技开发有限责任公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(苏州岛津公司)；F-4500型荧光光度计(日本日立公司).

1.2实验方法

1.2.1 中草药样品总黄酮的提取方法

将所中草药自然干燥，粉碎，过60目筛.分别准确称取处理好的中草药粉末0.5 g置于圆底烧瓶中，加入60%的乙醇溶液20 mL，功率为400 W条件下,微波提取6 min.提取完毕后，用60%的乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中，冷却过滤，备用.

1.2.2 测定的方法

直接测定的方法见文献[2]、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法见文献[3]、AlCl3显色法见文献[4]、示差分光光度法见文献[5]、荧光分光光度法见文献[6],表1为五种测定方法的标准曲线.

表1 五种测定方法的标准曲线

精确取黄酮提取液1.0 mL，按标准曲线的方法配制溶液，分别测定其光信号，代入标准曲线计算得黄酮浓度，把计算所得浓度代入以下公式进行计算，黄酮提取率%=(C×D×V×10-6/m)×100.式中：V为定容体积(mL)；m为中药研磨粉质量(g)；C为黄酮提取液的浓度(μg/mL)，D为稀释因子.

2 结果与讨论

分别取0.5 g中药粉末，根据实验方法1.2的提取测定方法得出十种中药总黄酮含量,见表2.

表2 十种中药总黄酮含量测定结果比较

续表

2.1直接测定法结果分析

表2第一列表明，黄酮类物质在紫外区有吸收，直接测定法可用于测定陈皮、甘草、银杏叶中黄酮含量较好.

大多数黄酮类化合物分子中存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系, 这种结构在200～400 nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带: 峰带Ⅰ( 300～400 nm) 和峰带Ⅱ(220～280 nm)[7].推测陈皮、甘草、银杏叶中的黄酮类化合物分子中可能含桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系.

图1 肉桂酰基和苯甲酰基的交叉共轭体系

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定结果分析

表2第二列表明，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法可用于测定山楂、黄芪中总黄酮的含量.

具有3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基的黄酮类化合物与NaNO2和Al(NO3)3可形成配合物，并在碱性条件下进一步重排成红色产物，使吸收峰红移的性质[9]，在500 nm左右有最大吸收.通过显色实验测定山楂、黄芪中的黄酮含量最高，结果推测葛根、山楂、连翘中的黄酮可能含3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基这样的结构.

2.3 AlCl3显色法的测定结果分析

表2第三列表明：Al3+可与黄酮的3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基和B环邻二酚羟基络合，使黄酮的紫外吸收谱带红移至420 nm.当黄酮缺乏3-羟基和B环邻二酚羟基时，其和B环桂皮酰基系统不会与Al3+络合而使紫外吸收谱带发生红移，不能用该法测定含量.而对于邻二酚羟基的酚酸类化合物，AlCl3显色前后在420 nm没有吸收峰，不产生干扰[7].

利用Hac-NaAc缓冲液体系，使反应系统pH值稳定在5.5, AlCl3法可用于陈皮中黄酮的含量的测定.故推测陈皮中的黄酮可能含有3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基和B环邻二酚羟基这样的结构.

图2 邻二酚羟基黄酮与铝的配合物结构式

2.4示差分光光度法测定结果分析

表2第四列结果表明：在本实验条件下，示差分光光度法可用于野菊花、山楂、连翘和葛根中黄酮含量的测定.

以碱性供试品溶液为参比,且样品中共存的其它组分( 如叶绿素) 由于在此波长下不发生吸收性质改变[10], 因而对测定无影响, 可较好解决背景吸收的问题.消除了样品中在碱性条件下吸收带的红移所产生的对中药材中总黄酮含量测定的干扰, 建立了中药材中总黄酮含量的测定方法, 此法也可用于有类似问题的中药中总黄酮含量的测定.

2.5荧光分光光度法测定测定结果分析

表2第五列结果表明：在本实验条件下，荧光光度法可用于除山楂以外的9种中药黄酮含量的测定，且陈皮的响应最灵敏.采用荧光光度法测定十种中草药中的总黄酮含量，可排除一些常见金属离子的干扰.

当黄酮分子中具有3-羟基(或5-羟基时)，可与Al3+配位络合显色，成为荧光光度测定黄酮类化合物的基础.芦丁中加入Al3+后，2个芦丁分子与3个Al3+络合，生成2 ∶3的络合物.芦丁中3′位的羟基和4′位的羟基与Al3+结合生成络合物的同时，两个芦丁分子中7′位的羟基与Al3+形成分子间的络合物，使络合物刚性增强，产生较强的荧光[11].因此，根据黄酮类化合物与铝离子形成稳定的荧光络合物的特点，采用荧光分析法测定中草药中总黄酮含量.因此推测大部分中草药黄酮可能含3-羟基或5-羟基这样的结构.

图3 3-羟基黄酮与铝的络合物结构式

3 结论

以芦丁为标准品测定十种中草药黄酮含量，通用方法为荧光光度法和差示分光光度法.荧光光度法适宜于测定除山楂外其它中药中总黄酮的含量，其灵敏度相对其他方法较高，不同的中草药中总黄酮结构不同需选择不同的测定方法，也可以根据其最佳的测定方法判断其结构.

直接测定法可用于测定陈皮、甘草、银杏叶中黄酮的含量，说明这三种中药中黄酮类化合物分子可能存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系；NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法可用于测定山楂、黄芪中总黄酮的含量，表示这三种中药中的黄酮类化合物分子中可能有游离的3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基存在；AlCl3法测定误差较大；示差分光光度法可用于野菊花、山楂、葛根和连翘中黄酮含量的测定，较好的解决了背景吸收问题；荧光光度法可用于除山楂以外的其它9种中药黄酮含量的测定，可能这几种中药黄酮分子含有像芦丁一样的结构，其3-羟基或5-羟基可与Al3+结合生成络合物.

[1] 钟永祥,卢秀琼,邹永东,等.结肠康颗粒剂的制备及质量标准研究[J].中草药,1998,29(8):528-530

[2] 王涛,江滨,曾元儿，等.四君子汤和煎液与单煎液中总黄铜的测定[J].时珍国医国药,2002,13(9):519-520

[3] 欧敏锐,许小平,邓焱杰，等.福建产白花蛇舌草活性成分提取与含量测定[J].海峡医药,2004,16(2):43-45

[4] 张磊,李辉敏.AB-8树脂分离提取复叶耳蕨中总黄酮含量测定[J].九江医学,2003,18(4):193-194

[5] 古丽娜尔·夏依马尔旦.几种中草药中总黄酮含量的测定[J].新疆师范大学学报,2009,28(1):67-70

[6] 穆宏磊,陈杭君,葛林梅，等.荧光光度法测定芦笋中总黄酮含量[J].中国食品学报,2010,2(10):201-205

[7] 池玉梅,居羚,邓海山,等.分光光度测定总黄酮法的适用性[J].分析化学研究简报, 2010,38(6):893-896

[8] 何书美,刘敬兰.茶叶中总黄酮含量测定方法的研究[J]. 分析化学研究简报,2007, 35 (9):1365-1368

[9] 任珊珊，包保全，毛婷,等.中药中总黄酮的含量测定方法研究进展[J].北方药,2015,12(3):112-115

[10] 严赞开.紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法[J].食品研究与开发，2007,28(9):164-167

[11] 鲁燕滨，王玉凤，陈林，等.两种测定水飞蓟胶囊中总黄酮含量方法的比较分[J].海南师范大学学报,2015,28(2):163-166

ResearchonDeterminationMethodofFlavonoidsofDifferentTraditionalChineseMedicine

ZHANG Min, LI Zhiying*

In order to investigate the best assay method of total flavonoids and the relationship between flavonoids structure and assay method, total flavonoids of ten traditional Chinese medicines were extracted by microwave technology and determined by different methods. The results showed that the direct methods were suitable for testing the total flavonoids ofGlycyrrhizauralensis, leaves ofGinkgobilobaand pericarpium citri reticulatae, the method of NaNO2-Al(NO3)3was suitable forCrataeguspinnatifidaandAstragalusmembranaceus, the method of differential spectrophotometry was suitable forChrysanthemumindicum,Crataeguspinnatifida,Puerarialobata, andForsythiasuspensa. The method of AlCl3was suitable for pericarpium citri reticulatae, and the method of fluorospectrophotometry was suitable for all apart from the hawthorn. The determination of total flavonoids in the Chinese medicines was affected by various factors, such as the types of flavonoids, the choice of measurement method, etc.

total flavonoid; spectrophotometry; Chinese herbs; structure of flavonoids

R 284.2

A

1674-4942(2017)03-0307-04

2016-12-15

忻州师范学院大学生科技创新项目资助(201588)

通迅作者： 李志英,教授,E-mail:lizhiying8001@163.com

10.12051/j.issn.1674-4942.2017.03.011

责任编辑：刘红