苁蓉总苷胶囊对AD大鼠行为学障碍的影响*

郑德俊 高俊鹏 方穗雄 张彦红 张丽华

（广州市第一人民医院·510180）

苁蓉总苷胶囊对AD大鼠行为学障碍的影响*

郑德俊 高俊鹏 方穗雄 张彦红 张丽华

（广州市第一人民医院·510180）

目的：探讨苁蓉总苷胶囊对阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）大鼠行为学障碍的影响。方法：用水迷宫法分别测试AD大鼠造模前后及给予苁蓉总苷胶囊干预后的学习记忆功能改善情况。结果：模型组AD大鼠在水迷宫找到平台的时间明显延长，经过的路程明显增加，给予苁蓉总苷胶囊2w后行为学改善明显。结论：苁蓉总苷胶囊可改善AD大鼠行为学障碍。

早老性痴呆 苁蓉总苷胶囊 行为学障碍

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)，又称早老性痴呆，统计表明，80岁以上老年人中AD患病率达到30%，全球AD患者数量为2600万左右。老年期痴呆，属中医学“老年呆证”、“文痴”“癫”、“言语错乱”、“郁证”等范围。既往研究表明苁蓉总苷胶囊治疗老年性痴呆取得较好疗效，本研究探讨了苁蓉总苷胶囊胶囊对AD老龄鼠行为学障碍的影响，了解其对AD作用及机理。苁蓉总苷胶囊可以有效改善痴呆患者的认知功能、行为生活能力[1]，但其机制目前未明。因此，本研究拟在前期研究基础上，以AD大鼠模型为研究对象，通过苁蓉总苷胶囊对AD模型鼠水迷宫试验进行检测，以期在动物模型中探索苁蓉总苷胶囊治疗AD的效果，为该药的进一步临床应用提供坚实的分子生物学理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

大于20个月龄雄性SD大鼠60只，清洁级，体重360±20g运到实验室，置于安静清洁环境下分笼喂养，室内温度控制在24±2℃，定时给予清洁饮水和大鼠专用饲料。适应性喂养一周后，无不良反应，饮食、饮水正常，即开始进行Y型水迷宫筛选，剔除不合格(即反应过于迟钝或特别敏感)的大鼠，再将合格大鼠分别称重后随机分为4组：正常组、假手术组、模型组、苁蓉总苷组，每组10只。

1.2 分组及受试对象给药方式

正常组：作为实验对照组，自由摄食及饮水，不作任何处理，待其余3组造模结束后与之同时进行Morris水迷宫定位航行实验和空间探索实验。

模型组：不进行任何治疗，自由摄食及饮水8周，即行造模(具体方法见后AD大鼠模型制备)，造模完毕后，大鼠正常喂养两周(以便药物的吸收)即行行为学检测。

假手术组：颅内注射与Aβ1-42等量生理盐水，余同模型组。

苁蓉总苷组：造模完毕后,大鼠正常喂养两周进行行为学检测。

1.3 模型制备

Aβ1-42孵育：试剂首先被溶解到0.4到4mol的二甲基亚砜溶液里，然后此溶液稀释在10mmol的磷酸二氢钠缓冲液中，37℃下孵育一周后使用。

造模方法：大鼠称重，用10%的水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于颅脑立体定位仪上保持前后囟在同一水平，剪开头皮，暴露前囟，按大鼠脑立体定位图谱进行定位，在前囟后方3.3mm，中线左右各旁开1.5mm，用牙科钻各钻一小孔穿颅(直径约1mm),垂直插入微量注射器，使针尖自颅骨表面缓慢进针3.3mm至海马。用微量注射器分别注入5μlAβ1-42，5min内注完，注射后留针5min，按1.0mm/min速度缓慢拔针。以免拔针时药物溢出。术后牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤，局部外敷青霉素G粉，并于术后三日内(包括当日)每日肌注青霉素G80万单位预防感染。

1.4 行为学检测方法

参照有关文献[1]操作，测试大鼠在Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）实验中逃避潜伏期的长短和跨越原平台区位置的次数，以了解大鼠的学习和记忆能力。而此过程又分为定位航行实验与空间探索实验。

1.4.1 定位航行实验 实验前1天(即在造模完成第14天)将大鼠放入水池自由游泳2min，让其熟悉水迷宫环境。正式水迷宫实验测试共历时5天，每天时间固定。实验开始时，将平台置于一个固定的象限，每个时间段分别从池壁四个起始点将大鼠面向池壁放入水池，大鼠入水点顺序为：第一天，E-S-W-N；第二天，S-W-N-E；第三天，W-N-E-S;第四天，N-E-W-S；第五天，E-W-N-S。记录每次找到平台的时间(即逃避潜伏期，以秒为单位计时)和距离（单位为cm）。如大鼠在120s内找不到平台，由实验者将其引上平台，潜伏期记为120s，每次间隔5min让大鼠休息，再行下次实验。

1.4.2 空间探索实验 定位航行实验第5天(既造模完成后第19天)的最后一次结束时撤除平台，将大鼠从任选的非平台象限入水点面向池壁放入水中，记录大鼠2min内跨越原平台的次数。

1.5 统计学处理

采用SPSS统计软件，计算大鼠定位航行实验中平均找到平台时间的均数，以及探索实验中跨越平台的次数。所得数据进行方差分析，根据方差结果，再选择相应的统计分析方法。

2 结果

2.1 造模后大鼠的一般情况

造模后发现大多数大鼠眼睑下垂，活动能力低下，自发运动减少；也有些大鼠术后自发运动增加。术后第2天所有存活的大鼠都恢复正常。在实验造模和饲养过程中部分大鼠死亡，最终完成实验各组例数见表1

2.2 造模对大鼠学习记忆的影响

在进行水迷宫实验前，用攀绳实验测定了全部大鼠的运动功能，结果表明全部大鼠的运动功能比较无统计学意义。

2.3 定位航行试验

从表1可见，与正常组相比，模型组的反应时间最长，(P＜0.01)；苁蓉组动物的反应时间显著短于模型组，有显著性差异(P＜0.01)。

表1 各组大鼠找到平台时间及平台距离比较

表1 各组大鼠找到平台时间及平台距离比较

注：1）与正常组比较，P＜0.01；2）与模型组比较P＜0.01

组别n找到平台时间（s）找到平台距离（cm）第1天第5天第1天第5天正常组1064.7±0.8041.6±0.861945.3±10.731145.76±10.09假手术组1071.63±0.911,2)64.8±0.651,2)2102.7±11.551,2)1843.7±10.641,2)模型组9100.3±2.321)97.9±1.311)4645.9±11.061)4169.7±11.341)苁蓉组1066.74±0.601,2)53.12±0.751,2)2167.58±12.241,2)1789.21±10.711,2)

2.4 空间探索实验

从表2中可见苁蓉组跨越平台次数明显多于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，与正常组相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)

表2 大鼠2min内跨越原平台的次数

3 讨论

阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease）又称早老性痴呆，是一种严重的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为进行性的认知功能减退，预后不良，患者一般死于肺栓塞和继发感染。阿尔兹海默病常散发，其临床发病率女性是男性的1.5-3倍。神经病理学特征主要包括β样淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积形成的细胞外老年斑（senile plaque,SP）、tau蛋白的过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结以及神经元的丢失伴随着胶质细胞的增生等，其发病机制与氧自由基损伤、炎症反应、蛋白质构象异常等有关。提示早期对高血压、高血脂等血管危险因素进行干预有助于预防AD。

阿尔兹海默病属中医学“老年呆证”、“癫”等范围。本病病位在脑与心、肾、肝、脾关系密切，其共同病因为痰瘀阻络、肝肾不足、脾肾不足或气虚血弱，兼风火、痰热为特点，证候多实或虚实并见，其治疗不宜一味进补，补则壅滞更甚[2]。苁蓉总苷胶囊具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效，现代广泛运用于老年性痴呆、阳痿、习惯性便秘等。现代药理学表明，肉苁蓉具有抗衰老、增强记忆、提高免疫力等多种功能。补肾中药肉苁蓉的有效成分苁蓉总苷可有效改善痴呆患者的认知功能、生活能力、行为及中医症状[4]。

本实验结果显示，阿尔兹海默病模型大鼠在水迷宫找到平台的时间明显延长，经过的路程明显增加，苁蓉总苷胶囊组大鼠在水迷宫找到平台的时间明显减少，经过的路程明显缩短，给予苁蓉总苷胶囊2w后行为学改善明显，表明苁蓉总苷胶囊可显著改善阿尔兹海默病模型大鼠的行为学障碍和学习记忆功能。

综上所述，我们认为，苁蓉总苷胶囊在早老性痴呆治疗中起到改善行为学障碍的作用。目前中药治疗早老性痴呆研究应突破局限于稳定血管，维持脑灌注方面，进一步可以通过对细胞周期蛋白CDK2、p21/cip的角度进一步阐明苁蓉总苷改善AD行为学障碍的可能机制，最终有助于中药在临床上更积极有效的应用于AD的早期干预。

[1] Wolozin, Benjamin. Cholesterol and the Biology of Alzheimer's Disease[J]. Neuron.2004,(41):7-10.

[2] 林志宏，朱丹妮，严永清，等.当归芍药散防治老年期痴呆的物质基础与作用机理研究I—组方作用协同性与选择性研究[J].中国实验方剂学杂志,2002,8(1):16-18.

[3] 杨建华,胡君萍,热娜·卡斯木，等.基于酵母双杂交技术筛选肉苁蓉降血脂活性成分[J].药效与毒理学研究.2011,22(3):252-255.

[4] 张彦红,朱磊,梁伟雄.苁蓉总苷胶囊治疗髓海不足型轻中度血管性痴呆40例[J].中医研究,2012;6(25):41-44.

广东省中医药管理局科研课题（项目编号：20141214）