叶绿素皂化反应条件的优化研究

张雪，郭宗明＊，李英，赵芳

（1.烟台南山学院，山东烟台 265713；2.龙口市检验检测中心，山东烟台 265700）

叶绿素皂化反应条件的优化研究

张雪1，郭宗明1＊，李英1，赵芳2

（1.烟台南山学院，山东烟台 265713；2.龙口市检验检测中心，山东烟台 265700）

叶绿素的皂化反应实验中常出现絮状浑浊、分层不清晰等异常现象。为避免这些异常现象的发生，本文运用单因素实验和正交实验设计方法研究叶绿素皂化反应的优化条件。研究结果表明，皂化反应优化条件为：叶绿素皂化反应的试剂加入量的最佳配比为叶绿素提取液1mL、乙醚4mL、蒸馏水3mL、30%KOH-甲醇4mL，皂化反应的效果最佳。

叶绿素；皂化反应；正交实验

叶绿素是存在于绿色植物中的天然色素，其分子结构包括一个亲水的头部和一个亲脂的尾部，亲水头部由四个吡咯环以氮原子与镁原子构成的卟啉骨架。卟啉具有极性，亲水，可以与蛋白质结合。尾部的叶绿醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，其决定了叶绿素的脂溶性。

叶绿素是叶绿酸的酯，叶绿酸是双羧酸，一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素可以与碱发生皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水[1]，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。在实验过程中，发现皂化反应的现象有差异[2]。皂化反应分层状况不一，有的上层为黄色的乙醚溶液，下层为绿色的酒精溶液；有的两层之间有一层浅色乳白色的溶液层或乳胶状的薄层；有的分层效果非常好。呈现上下的黄绿两层。为了较好解决皂化反应的存在不一致问题。开展了叶绿素皂化反应的实验条件的优化研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原料：新鲜的菠菜叶。试剂：无水乙醇、30%KOH-甲醇溶液、乙醚。

1.2 叶绿素的提取

取新鲜菠菜叶片洗净、吸干，称量5g叶片，剪碎后放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂，2～3mL无水乙醇，研磨成糊状，再加2～3mL无水乙醇，过滤得到色素提取液[3-4]。

1.3 皂化反应的单因素试验设计

取1mL叶绿素提取液，以蒸馏水，甲醇，乙醚三种试剂分别作为单变量，按2、3、4、5mL分别加入试管进行实验分析。观察蒸馏水、甲醇、乙醚的加入量对皂化反应的影响。

1.4 皂化反应的正交试验设计

在单因素分析的基础上，采用二水平四因素的正交试验设计[5]，研究试剂使用量对皂化反应的影响。正交试验设计见表1。

表1 叶绿素皂化实验正交试验设计表

1.5 皂化反应效果的评价标准

以分层清晰度、浑浊层厚度、液层颜色这三个方面来判定叶绿素皂化反应的实验效果，每项指标满分为20分，分4个等级，每个等级分别为5、10、15、20分，具体见表2。

表2 叶绿素皂化实验效果的评价标准

2 实验结果与讨论

2.1 单因素实验结果

以叶绿素皂化反应出现分层、界限清晰，无浑浊层、上黄色下绿色为最佳判断标准。单因素实验结果见表3、表4和表5.结果显示，蒸馏水、甲醇、乙醚三种试剂的加入量分别为3、4mL时皂化反应现象明显。

表3 水的单因素实验结果

表4 甲醇的单因素实验结果

表5 乙醚的单因素实验结果

表6 二水平四因素正交实验结果

常世民对叶绿素皂化反应实验中出现的乳化现象进行研究，提出加入几滴1%～3%NaCl代替蒸馏水和用稀酸代替蒸馏水的改进方法。单因素实验的结果表明，不需加入盐或酸，只要把握好参与皂化反应的试剂的用量，就能达到很好的实验效果。

2.2 正交实验结果

根据正交试验设计，做出16组皂化反应实验。从分层清晰度、浑浊层厚度、液层颜色三方面对16组皂化反应的结果进行评价。由表6可知，四个因素中对皂化反应影响最大的是乙醚（B），其次是叶绿素提取液（A）和蒸馏水（C），影响最小的因素30%的氢氧化钾-甲醇液（D）。从皂化反应的结果评价分值看，皂化反应的试剂加入量的最佳配比为A1B2C1D2（图1），即叶绿素提取液1mL、乙醚4mL、蒸馏水3mL、30%KOH-甲醇4mL皂化反应效果最佳。将正交实验结果评价得分为58分以上的几组再次进行皂化反应，对皂化反应的实验效果进行比较评价，确定皂化反应的试剂加入量的最佳配比为A1B2C1D2。

2.3 皂化反应优化条件下效果

皂化反应优化条件A1B2C1D2下，反应效果如图1所示。

图1 A1B2C1D2皂化反应结果图

叶绿素与碱发生皂化反应生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，叶绿酸盐的分子极性大，易容于水中，不能进入乙醚层中，而类胡萝卜素在乙醚中的溶解度大于在醇溶液中。说明在叶绿素皂化反应后乙醚是促进形成液体分为上层（黄色）下层（绿色）的关键因素。正交实验的结果证明，乙醚是影响叶绿素皂化反应的最主要因素，其次叶绿素提取液和蒸馏水，两者对皂化反应的影响大致相同，而30%氢氧化钾-甲醇对皂化反应的影响最小。从16组正交实验的结果看，乙醚为4mL的皂化反应结果明显好于乙醚为3mL的皂化反应结果。乙醚溶解类胡萝卜素，加入适当多的乙醚能促进叶绿素与类胡萝卜素很好地分离，达到理想的叶绿素皂化反应实验效果。

3 结论

由单因素和正交实验结果可以得知，叶绿素皂化实验的效果与水、乙醚、甲醇三个因素密切相关。乙醚微溶于水的性质决定皂化反应实验中胡萝卜素色素与叶绿酸盐的分离，但黄色、绿色分层清晰，乙醚的用量是关键因素。

[1]凃大正.植物生理学,修订本[M].长春:东北师范大学出版社,1998.

[2]常世民.叶绿素皂化反应释疑及改进方法[J].廊坊师范学院学报,2001,17(4):83-84.

[3]杨国恩,吴志平,李坤平,等.竹叶叶绿素的提取及其性质的稳定性[J].中南林学院学报,2005,25(3):106-110.

[4]吴荣金,林泽浩,陈键,等.凤眼莲叶叶绿素的提取及其性质的稳定性[J].仪器仪表与分析检测,2007，(1):32-33,39.

[5]杜双奎,李志西.食品试验优化设计[M].北京:中国轻工业出版社,2011.

Study on the Optimization Condition of Chlorophyll Saponification Reaction

Zhang Xue1,Guo Zong-ming1*,Li Ying1,Zhao Fang2
(1.Yantai Nanshan University,Yantai Shandong 265713;2.Inspection and Testing Center of Longkou City,Yantai Shandong 265700)

It often occurs abnormal problems such as floc and blurred liquid layer in the experiment of the chlorophyll saponification reaction.In order to solve this question,we explored the optimization condition of chlorophyll saponification reaction based on one-factor at a time and orthogonal array design methods.The results prove that the best proportion of reagents used in the chlorophyll saponification reaction is conducted by chlorophyll extract for 1mL diethyl ether for 4mL,distilled water for 3mL and sodium hydroxide- methanol solution 30% for 4mL.

Chlorophyll;Saponification reaction;Orthogonal array design

O621.25

A

2096-0387（2017）05-0060-03

山东省教育科学研究课题项目（16SC100）。

张雪（1994—），女，河南焦作人，本科，研究方向：食品质量控制与安全管理。

郭宗明（1966—），男，江苏徐州人，博士，副教授，研究方向：营养分析与检测。