山东省鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定

李伟跃 ， 张兰凤 ， 李胜美 ， 石 英

(1.山东畜牧兽医职业学院 ， 山东 潍坊 261061 ； 2.山东省潍坊新华中学 ， 山东 潍坊 261061)

山东省鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定

李伟跃1， 张兰凤2， 李胜美2， 石 英1

(1.山东畜牧兽医职业学院 ， 山东 潍坊 261061 ； 2.山东省潍坊新华中学 ， 山东 潍坊 261061)

鸡的大肠杆菌病是由某些血清型的大肠杆菌引起的一类疾病，随着养鸡业的集约化发展，该病的传播越来越严重，对养鸡业造成的经济损失巨大。为明确本省致病性大肠杆菌的血清型、有针对性地研究预防和治疗鸡大肠杆菌病的药物和方法，对山东省鸡致病性大肠杆菌进行了分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 病料及分型血清 病料采自山东省德州市兽医站禽病门诊、淄博市兽医站禽病门诊、沂水县兽医站禽病门诊，胶州市、莱州市、临朐县等多个肉鸡养殖场和禽病门诊的疑似大肠杆菌病的病、死鸡，具有典型肝周炎、心包炎解剖病变的病死鸡的脾脏、肝脏、心血等病料。大肠杆菌标准菌株ATCC25922和大肠杆菌标准抗“O”血清，均购自中国兽医药品监察所。

1.2 试剂和培养基 三糖铁琼脂、营养肉汤、普通营养琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；麦康凯、伊红美兰琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇微量发酵管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂、革兰染色液、0.5%石炭酸生理盐水、吲哚试剂、V-P试剂、M-R试剂等由实验室自行配制。

1.3 试剂配制方法 以下试剂按照参照参考文献[1]进行配制。蛋白胨水：蛋白胨 1 g，氯化钠 0.5 g，蒸馏水100 mL。将蛋白胨、氯化钠加入蒸馏水中，加热溶解后调pH值为7.6，再煮沸加热30 min。待冷后用滤纸过滤，分装，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。葡萄糖蛋白胨水： 蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，K2HPO40.5 g，完全溶解于100 mL蒸馏水中后，分装试管，115 ℃高压蒸汽灭菌15 min。枸橼酸盐琼脂：硫酸镁0.2 g，磷酸二氢铵1.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，枸橼酸钠2.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20 g，1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10 mL，蒸馏水1 000 mL。除溴麝香草酚蓝酒精溶液外，其他成分混合于蒸馏水中，加热溶解，调整pH值为7.0，再加入溴麝香草酚蓝酒精溶液，混匀后121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，摆成斜面。培养基呈淡绿色。草酸铵结晶紫：取结晶紫饱和溶液(13.87 g结晶紫溶于100 mL 95%酒精)2 mL，加蒸馏水18 mL稀释10倍，再加入1%草酸铵水溶液80 mL，混合过滤。革兰碘液：碘化钾2 g置乳钵中，加蒸馏水约5 mL，再加碘粒1 g，研磨，并徐徐加水至完全溶解后注入棕色瓶中，补加蒸馏水至300 mL。沙黄：将沙黄饱和溶液(3.41 g沙黄溶于100 mL 95%酒精)用蒸馏水稀释10倍。吲哚试剂：对位二氨基苯甲醛1 g，溶于无水乙醇95 mL后加入浓盐酸20 mL，避光保存。M-R试剂：甲基红0.02 g，95%酒精60 mL，蒸馏水40 mL。V-P试剂：甲液：α-萘酚酒精溶液(α-萘酚5 g，无水乙醇100 mL)；乙液：40%KOH溶液(KOH 40 g，蒸馏水100 mL)。0.5%石炭酸生理盐水：石炭酸0.5 g，蒸馏水100 mL。

1.4 主要仪器设备 超净工作台(中国蚌埠计划设备厂)；电热恒温培养箱(中国龙口市先科仪器公司)；高压蒸汽灭菌锅(上海通用核子仪器厂)；显微镜(日本OLYMPUS)；游标卡尺、培养皿以及实验室常用玻璃仪器等。

1.5 方法

1.5.1 细菌分离培养及形态学观察 将采集到的病料直接涂片镜检和分离培养。直接涂片，若观察到革兰阴性无芽孢短杆菌可作为初步诊断；将病料取出，分别接种于麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、普通肉汤、普通营养琼脂培养基上，放在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，在伊红美蓝琼脂上长出带金属光泽的紫黑色菌落；在麦康凯培养基上长出红色菌落；在普通培养基上形成中等大小、光滑湿润、圆形凸起、灰白色边缘整齐的菌落；普通肉汤中呈均匀浑浊生长，形成菌膜，管底有黏性沉淀。挑取符合特征的单菌落进行革兰染色，镜检，大肠杆菌为革兰阴性无芽孢短杆菌。

1.5.2 生化试验[2]用五糖发酵(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖)、IMViC、三糖铁试验进行生化鉴定。按照常规方法用灭菌接种环挑取普通琼脂斜面上的纯培养物少许，进行三糖铁、五糖发酵、IMViC试验。本菌能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，不分解蔗糖；三糖铁斜面和底部均为黄色，且底部有气体产生，但不产生H2S；IMViC的试验结果为++――。

1.5.3 血清型鉴定

(1)抗原制备：先用2 mL 0.5%石炭酸生理盐水将普通琼脂斜面小管中的培养物洗下，放到小圆底试管中，制作成浓稠菌悬液，再放入高压蒸汽灭菌锅中121.3 ℃高压2 h，以破坏其“K”抗原，制得高压抗原，然后鉴定“O”抗原。

(2)血清型鉴定：加样：取干净玻璃板，用蜡笔将其划成方格，并注明每格相对应的血清标号，每板4种血清，用微量加样器向每格加一种血清10 μL，再用微量移液器在血清附近滴加一种被检菌“O”抗原10 μL，但不与血清接触，用火柴棒将血清与抗原混匀。对照：每次试验同时以0.5%苯酚生理盐水和高压抗原混合物作对照，观察是否有自凝现象。判定：3 min内出现凝集者为阳性反应。

2 结果

2.1 细菌在不同培养基上的培养特性 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂上形成带金属光泽的紫黑色菌落；在麦康凯琼脂平板上形成玫瑰红色中等大小的菌落；在普通琼脂平板上形成灰白色、湿润、半透明、边缘整齐、表面光滑的中等大小菌落；在普通肉汤中呈均匀浑浊生长，有菌膜、管底有黏性沉淀；革兰染色镜检可见多数散在排列的两端钝圆的短杆菌，呈粉红色，为革兰阴性菌。共分离到150株菌株。

2.2 生化试验结果 将分离到150株菌株按照常规方法采用五糖发酵、三糖铁、IMViC试验，进行生化鉴定，结果见表1。

表1 150株大肠杆菌的生化鉴定结果

+：阳性；-：阴性；A：产酸

2.3 血清型鉴定结果 用玻板凝集法对150株大肠杆菌进行“O”血清型鉴定，结果见表2。

所分离的150株大肠杆菌中，有16株未定性，2株出现玻板凝集或自凝现象，其他132株分离的“O”型血清共有16种；血清型鉴定结果为，O78血清型的菌株最多，共计45株，占菌株的30.0%，O24a、O111和O5分别为12.7%、9.3%和8.0%，为优势血清型。

表2 150株大肠杆菌的血清型鉴定结果

3 讨论

大肠杆菌的不同血清型之间交叉保护率低，不同地区大肠杆菌的血清型种类繁多而且差异较大，为鸡大肠杆菌病的防治带来了较大的困难。在鸡大肠杆菌病传统的流行病学研究中，血清型鉴定占有重要地位，对于由不同血清型大肠杆菌所导致的疾病，血清学分型具有更加重要的指导意义；明确山东省大肠杆菌血清型的分布和不同血清型之间的交叉保护力，对于山东省鸡大肠杆菌病疫苗的研制和预防具有重要意义。

本试验结果显示，山东省肉鸡大肠杆菌的优势血清型是O78、O24a、O111和O5，分别占鉴定菌株的30.0%、12.6%、9.3%和8.0%。国外有很多关于大肠杆菌血清型鉴定的报道，不同地区流行的优势血清型所占的比例差异非常大，但最常见的优势血清型通常是O78[4]。本次试验分离所得的4个优势血清型中O78也是常见血清型，而O24a、O5却不在此列，特别是我们在不同养鸡场分离到的19株O24a血清型的大肠杆菌，在其他地区未见报道，这可能与当地引种范围较广有关，因此有必要对其进行进一步研究。本次试验未发现O93、O88、O76、O35、O25、O20、O14、O11、O8血清型，与李宏娟报道的O26和O88是山东地区优势血清型不一致[5]。O116、O24b、O21、O15、O9、O7、O2占比例较低。山东省2000年17个地市的养鸡场致病性大肠杆菌血清型中，O2、O11、O15、O18、O78、O143最为常见[6]，其结果中只有O78与本试验相同。

从结果也可看出，山东省鸡群大肠杆菌血清型分布复杂，不同地区之间血清型有差异，从同一地区甚至同一鸡群分离到的大肠杆菌菌株其血清型也不同。大肠杆菌血清型的组成如此复杂，给养鸡生产中该病的防治造成了很大困难。因此，通过筛选地区性免疫原性优良的大肠杆菌菌株制作菌苗，是鸡大肠杆菌病免疫预防的基础。建议鸡场最好采用自家灭活苗预防较为可靠。

[1] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M]. 北京：中国农业出版社，2002.

[2] 沈萍,范秀容,李广武．微生物学实验[M].北京:高等教育出版社，2004.

[3] 从佩清. 鸡大肠杆菌病地方性致病菌株的分离鉴定及免疫研究[J].吉林农业大学学报，1997，19(3)：72-77.

[4] 张春荣，苏亚拉图.我国流行的鸡致病性大肠杆菌血清型[J]. 中国动物检疫，1996，16(1)：2-8.

[5] 李宏娟.鸡致病性大肠杆菌耐药性监测及基因型研究[D].保定：河北农业大学，2008.

[6] 丁伯良，王英珍，李秀丽，等.天津地区鸡致病性大肠杆菌血清型分布及其优势血清型的外膜蛋白型研究[J].动物医学进展，2003，24(2)：94-96.

R378.2+1

B

0529-6005(2017)09-0038-02

2016-12-05

李伟跃(1968-)，男，副教授，博士，主要从事动物营养与免疫研究，E-mail:zhmy.lizihao@163.com