板蓝根微粉对雏鸡大肠杆菌病的防治试验

黄 慧 ， 姜晓文 ， 于文会 ， 侯耀杰 ， 李叔洪 ， 王金玉 , 郝敬友

(1.东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030 ; 2.哈尔滨绿达生动物药业有限公司 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

板蓝根微粉对雏鸡大肠杆菌病的防治试验

黄 慧1， 姜晓文1， 于文会1， 侯耀杰1， 李叔洪1， 王金玉1, 郝敬友2

(1.东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030 ; 2.哈尔滨绿达生动物药业有限公司 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

为了研究板蓝根超微粉对雏鸡大肠杆菌病的临床疗效，试验以板蓝根普通粉做对照。利用50 ℃温水提取板蓝根超微粉和普通粉活性成分，水溶性活性成分告依春的高效液相检测，并将水提取物进行体外抑菌试验和体内防治试验。试验将9日龄雄性雏鸡270只，随机分为9组，每组30只。分为2个预防组、5个治疗组、模型组及空白组。试验结果：板蓝根超微粉和普通粉中告依春含量分别为1.681mg/g，1.067mg/g；板蓝根超微粉对大肠杆菌的抑菌效果高度敏感，其抑菌效果大于普通粉，抑菌环分别为16 mm和13 mm。体内试验结果显示，板蓝根超微粉预防有效率90%，普通粉预防有效率73.33%；板蓝根超微粉治愈率为83.33%，普通粉治愈率为70%，氧氟沙星治愈率为86.7%。结论：板蓝根超微粉水溶性活性成分告依春溶出率优于普通粉，超微粉体外抑菌和体内对雏鸡大肠杆菌病的防治均优于板蓝根普通粉。

板蓝根超微粉 ； 雏鸡 ； 大肠杆菌病防治

超微粉碎技术因其粉体理化性质独特，粉体比表面积和孔隙率增大等优点被引入中药加工领域[1]。一般粉碎技术对植物细胞的破壁率较低，一些活性成分不能释放出来，影响其疗效[2]。采用超微粉碎技术对天然植物进行加工，天然植物细胞的破壁率可达100%，减小其有效成分溶出时所受到的阻力，活性成分的溶出率提高，减小了服用剂量，节省原料，降低成本[3]。中草药经超微粉碎后，细胞破壁率高，有效成分不需要通过细胞壁可直接曝露出来，提高天然植物有效成分的溶出量和溶出度，吸收速度加快，打破长期以来“中药起效慢、作用强度低”的思维定势[4]。但因粉体比表面积增大，吸附性强且流动性变差，致使颗粒处于不稳定状态，易吸潮及吸附空气中的杂质，同时还易形成假大颗粒[5]等不利因素。板蓝根是中兽医临床常用的清热解毒药，生物碱类、有机酸类、黄酮类、核苷酸类、氨基酸类、多糖类、芥子苷类等大约100多种天然成分[6]。板蓝根有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)均有抑制作用，其抑菌成分为色胺酮类生物碱[7]。研究表明，板蓝根不仅具有抑菌杀菌的作用，还有抑制细胞因子活性和抗内毒素作用[8]。本试验通过雏鸡大肠杆菌病模型，深入研究板蓝根超微粉对鸡大肠杆菌病的防治效果，为今后中药超微粉碎技术的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 板蓝根浸提液的制备 将板蓝根超微粉和普通粉温水(50 ℃)浸提0.5 h，离心后浓缩至浓度为1.0 g/mL的原药液，高压灭菌后，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 (R,S)-告依春的含量测定 (1) 色谱条件 色谱柱：C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相：V(甲醇):V(1mL/L磷酸)=7∶93。流速：1.0 mL/min。柱温度：30 ℃±5 ℃。进样量：10 μL。检测波长：245 nm；(2)(R,S)-告依春对照品溶液的制备 用电子天平精密称取(R,S)-告依春标准品5 mg，甲醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀，倍比稀释得到浓度分别为200 μg/mL ,100 μg/mL, 50 μg/mL ,25 μg/mL ,12.5 μg/mL的标准品溶液。超声使其充分溶解，4 ℃冰箱保存备用；(3)标准曲线的制备 以标准品浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。

1.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 MIC测定：采用二倍稀释法测定MIC。MBC测定：取不发生浑浊变化的试管内培养液接种于营养平皿，培养18 h后观察菌落数确定MBC。

1.4 最佳感染剂量的确定 将12日龄健康雏鸡135只随机分为9组，每组15只，将菌液依次稀释为9个不同浓度，分别为2.36×109、1.68×109、8.4×108、4.2×108、2.1×108、1.05×108、5.25×107、2.63×107、1.81×107，每组雏鸡胸肌注射不同浓度的菌液0.5 mL/只，记录72 h内雏鸡的发病情况及死亡率。以死亡率在60%～90%的攻菌剂量为最佳感染剂量。

1.5 试验雏鸡分组与给药 将9日龄雄性雏鸡270只，随机分30只雏鸡为空白组(A)和240只雏鸡为感染组，感染组共8组，分为模型组(B)，西药治疗组(C)，超微粉高剂量治疗组(D)，超微粉中剂量治疗组(E)，超微粉低剂量治疗组(F)，普通粉治疗组(G)，超微粉预防组(H)，普通粉预防组(I)，每组30只。

预防组于9日龄灌服浓度为0.25 g/mL板蓝根超微粉和普通粉浸提物，给药量为0.5 mL/只，连续灌服3 d。12日龄时，除空白组外，其余各组雏鸡进行胸肌注射大肠杆菌菌液0.5 mL/只。6～12 h部分雏鸡出现临床症状后，D组、E组、F组分别按浓度1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL进行治疗，G组按浓度1 g/mL进行治疗，D组、E组、F组、G组给药剂量为 0.5 mL/只。C组按浓度2.5 g/L的氧氟沙星水溶液自由饮水给药；A组与B组灌服等量的生理盐水，连续给药5 d，观察7 d，观察并记录鸡只发病情况。

1.6 免疫器官指数的测定 试验结束后各组随机选取5只雏鸡进行剖检，观察病变特征，并取胸腺和腔上囊，计算免疫器官指数。

免疫器官指数(mg/g)=免疫器官重(mg)/体重(g)

1.7 血清生化指标及细胞因子的测定 各组分别于给药后的第3天、5天、7天时，随机选取5只雏鸡空腹12 h，心脏采血，分离血清测定IL-1、TNF-α、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CREA)、尿酸(URIC)含量。

2 结果

2.1 板蓝根中(R,S)-告依春的含量 (R,S)-告依春标准曲线为y=40733x+145072，R2=0.999 7。由图1可知，板蓝根超微粉和普通粉的出峰时间分别为10.964 min，10.947 min。积分面积分别为25692100, 2862088。(R,S)-告依春的含量分别为1.681 mg/g，1.067 mg/g。

2.2 板蓝根超微粉与普通粉对大肠杆菌O78体外抑菌活性检测结果 药敏试验结果表明，板蓝根超微粉对大肠杆菌的抑菌效果高度敏感，其抑菌圈大于普通粉，分别为16 mm和13 mm。两种板蓝根粉末最小抑菌浓度(MIC)分别为0.125 g/mL和0.25 g/mL，最小杀菌浓度(MBC)均为0.5 g/mL，无差异。由此可知，板蓝根超微粉和普通粉对大肠杆菌均有明显抑菌效果，且板蓝根超微粉抑菌作用好于板蓝根普通粉。

2.3 雏鸡大肠杆菌病模型制备结果 4.2×108CFU/mL的剂量组死亡率为73.33%，按照死亡率在60%～90%的攻菌剂量为最佳感染剂量，所以选择4.2×108CFU/mL为最佳感染剂量。攻菌6 h后除空白组和两组预防组外，其他各组雏鸡出现扎堆，缩头，两翅下垂，精神不振，闭眼昏睡等症状且排黄色或白色稀便，偶有严重者卧地不起，10 h后预防两组开始出现临床症状；12 h时，开始出现死亡鸡只，两组预防组部分未发病，其余各组发病率近100%。

图1 板蓝根中(R,S)-告依春积分图

表1 板蓝根抑菌活性及MIC、MBC的检测结果

2.4 板蓝根超微粉和普通粉对雏鸡大肠杆菌病的防治试验结果 由图2可知，与B组比较，各给药组均可有效降低死亡率，H组死亡率最低为10%。预防试验中，H组治愈率显著高于I组，为83.33%；治疗组中，超微粉各剂量组的治愈率、有效率均优于普通粉各组。

图2 板蓝根对雏鸡大肠杆菌病的防治结果/%

2.5 板蓝根超微粉对雏鸡大肠杆菌病免疫器官指数的影响测定结果 由图3可知，板蓝根超微粉和普通粉对大肠杆菌感染的雏鸡免疫器官发育有促进作用，且治疗组和预防组的效果均是板蓝根超微粉优于普通粉。

2.6 板蓝根微粉对雏鸡大肠杆菌病血清中相关细胞因子影响测定结果 如图4，图5可知，雏鸡血清白细胞介素-1在5 d时，D组和H组IL-1含量较B组低，差异显著(P<0.05)；7 d时，D组与B组差异极显著(P<0.01)，D组效果优于G组。雏鸡血清肿瘤坏死因子-α在5 d、7 d时，B组显著高于A组(P<0.05)，各组含量均显著低于B组(P<0.05)，D组与G组间无明显差异(P>0.05)。

图3感染大肠杆菌的雏鸡免疫器官指数的测定结果

注：与空白组比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与感染对照组比较，△表示差异显著
(P<0.05)，△△表示差异极显著(P<0.01)，下图同

2.7 板蓝根微粉对雏鸡大肠杆菌病血清中转氨酶活性影响测定结果 由图6，图7可知，给药5 d、7 d时，B组谷丙转氨酶活性极显著高于各给药组(P<0.01)，各给药组间无显著差异(P>0.05)。5d时，C组、D组、G组的谷草转氨酶活性较B组低，差异极显著(P<0.01)，7 d时各给药组谷草转氨酶活性显著低于B组(P<0.05)。

2.8 板蓝根对雏鸡大肠杆菌病血清中肌酐、尿酸影响测定结果 由图8，图9可知，7 d时D组和H组的CREA含量显著低于B组(P<0.05)；给药3 d、5 d时，B组的URIC含量极显著高于A组(P<0.01)，各给药组均极显著降低了URIC的含量(P<0.01)，7 d时，B组与A组差异显著(P<0.05)。

图4 感染大肠杆菌的雏鸡血清白细胞介素-1(IL-1)的测定结果

图5 对大肠杆菌感染的雏鸡血清肿瘤坏死因子测定结果

图6 感染大肠杆菌的雏鸡血清中谷丙转氨酶(AST)活性的测定结果

图7 感染大肠杆菌的雏鸡血清谷草转氨酶(ALT)活性的测定结果

图8 感染大肠杆菌的雏鸡血清肌酐(CREA)活性的测定结果

图9 对大肠杆菌感染的雏鸡血清尿酸(URIC)活性的测定结果

3 讨论

板蓝根超微粉粉体粒径小，细胞破壁率高，有效成分不需要受细胞壁的阻力而直接快速溢出。溶出量和溶出速度均有提高，且化学结构不发生改变保持原有的生物活性[9]。本试验研究结果可知，板蓝根超微粉中告依春溶出的量较普通粉多，且溶出的速度快，超微粉中告依春溶出量是普通粉的1.58倍。超微粉体外抑菌和体内对雏鸡大肠杆菌病的防治均优于板蓝根普通粉。

板蓝根作为清热药对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有广谱的抗菌作用，由于其化学成分复杂，具体的抗菌机制尚未明确，有效成分可能是一种，也可能是多种成分共同发挥作用[10]。而糖类、氨基酸类化合物对机体有免疫调节作用，有助于提高机体抗病能力，在抗菌过程中发挥一定作用[11-12]。本实验对板蓝根超微粉和普通粉抗鸡源性大肠杆菌效果进行对比研究，体外抑菌试验结果表明，两种粒度的板蓝根粉末对鸡源性大肠杆菌均有明显的抑菌效果。药敏试验测得板蓝根超微粉和普通粉的抑菌圈分别为16 mm和13 mm，超微粉抑菌效果较普通粉敏感。板蓝根抗菌可以通过影响细菌的呼吸和代谢，起到直接抑制细菌生长或杀死细菌的作用[13]；板蓝根中的活性成分与细菌的 DNA形成复合物，影响细菌 DNA 的复制，干扰细菌的繁殖[14]；也可直接作用于细菌的细胞壁，抑制细胞壁的合成[15]；通过改善机体免疫功能，提高机体的抗应激能力，进而增强机体非特异性防御机能[16]。大肠杆菌的主要致病机制是引起雏鸡严重的急性炎症反应，造成肝、肾损伤。其炎性反应与IL-1、TNF-α等炎性因子密切相关[17]。试验结果表明，板蓝根各给药组及西药对照组均可降低血清中IL-1、TNF-α的含量，且超微粉效果最佳，3 d时较感染对照组比IL-1、TNF-α的含量均显著降低，5 d时的含量即与空白组相近，说明板蓝根超微粉能快速有效的降低雏鸡大肠杆菌病的炎性因子水平，减轻炎症反应。从肝、肾功能指标上看，板蓝根超微粉及普通粉均有保护肝肾及对肝肾损伤具有修复作用，但超微粉效果优于普通粉。其作用机制是板蓝根中的活性成分通过抗炎或中和细菌毒素来发挥作用，还待于进一步研究。

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ThestudyofRadixIsatidisSuperfinePowderonChickColibacillosis

HUANG Hui1, JIANG Xiao-wen1, YU Wen-hui1, HOU Yao-jie1, LI Shu-hong1, WANG Jin-yu1, HAO Jing-you2

(1.College of veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Harbin Lvdasheng Animal Pharmaceutical Co.,Ltd,Harbin 150030,China)

In order to study the clinical effect of ultra fine powder of Radix Isatidis on Colibacillosis in chickens, Radix Isatidis powder was taken as control group. The active ingredients of ultra fine powder and ordinary powder were extracted with 50℃ water. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the water soluble active components content of epigoitrin, and water soluble active ingredients were tested for bacteriostatic experimentsinvitroand prevention experimentsinvivo270 male chickens of 9 day old were randomly divided into the following nine groups, two prevention groups, five treatment groups model group and control group,and each group had 30 chickens,The results showed that the contents of epigoitrin in ultra fine powder of Radix Isatidis and in Radix Isatidis were 1.681 mg/g and 1.067 mg/g, respectively.The ultra fine powder of Radix Isatidis was highly sensitive to the inhibitory effect ofEscherichiacoli, and its inhibition effect was greater than ordinary powder, the inhibition rings of ultra fine powder of Radix Isatidis and ordinary powder of Radix Isatidis were 16 mm and 13 mm, respectively.Invivostudy, the prevention efficiency of Radix Isatidis ultra fine powder was 90% and the prevention efficiency of common powder was 73.33%.The cure rate of ultrafine powder of Radix Isatidis was 83.33% and the cure rate ordinary powder was 70%.The cure rate of Ofloxacin was 86.7%.We conclude that the dissolution rate of water soluble active ingredient epigoitrin of Radix Isatidis ultrafine powder is better than that of ordinary powder, and the bacteriostatic of Colibacillosisinvitroand preventioninvivoof ultra fine powder of Radix Isatidis are better than ordinary powder of Radix Isatidis.

ultra fine powder of Radix Isatidis ; chicken ; prevention and treatment of colibacillosis

YU Wen-hui

R378.2+1

A

0529-6005(2017)09-0053-05

2017-05-02

黄慧(1990-)，男，硕士生，主要研究方向为中药抗菌及兽医临床应用，E-mail:773429067qq.com

于文会，E-mail:yuwenhui@neau.edu.cn