血管内皮生长因子及对氧磷酶1基因多态性与糖尿病视网膜病变的相关性*

卫钦锋，李先加

（1.西宁市第二人民医院眼科 810003；2.青海大学医学院藏医学院藏医系，西宁 810003）

论著·临床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.015

血管内皮生长因子及对氧磷酶1基因多态性与糖尿病视网膜病变的相关性*

卫钦锋1，李先加2

（1.西宁市第二人民医院眼科 810003；2.青海大学医学院藏医学院藏医系，西宁 810003）

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）、对氧磷酶1（PON1）基因多态性与糖尿病视网膜病变（DR）的相关性。方法选取2013年1月至2015年12月西宁市第二人民医院收治的糖尿病（DM）患者168例，将其分为DM组（48例）、增殖性DR（PDR）组（66例）和非增殖性DR（NPDR）组（54例）；另选取同期体检健康者104例作为对照组（NC组）。通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）测定血管内皮生长因子（VEGF）和对氧磷酶1（PON1）基因多态性，采用紫外分光光度计检测所有受试者超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平。结果与NC组比较，DM组、NPDR组及PDR组收缩压、糖化血红蛋白水平明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；而舒张压、胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。PDR组和NPDR组收缩压比较，差异有统计学意义（P<0.05），而舒张压、胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、糖化血红蛋白水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。CC、CT、TT基因型患者DR发生率分别为71.05%、56.27%、38.64%，CC基因型患者DR发生率明显高于CT和TT基因型患者，差异有统计学意义（P<0.05）。PON1 192位点不同基因型健康体检者SOD、MDA水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05），QQ基因型DR患者体内SOD水平低于QR、RR基因型患者，MDA水平高于QR、RR基因型患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论VEGF、PON1基因的表达影响DR的发生和进展，PON1基因可能通过影响DR患者体内氧化应激酶的表达控制疾病的发展。

血管内皮生长因子；对氧磷酶1；多态性，单核苷酸；糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是一种具有特异性的糖尿病（DM）微血管病变，是DM的并发症之一[1-2]。临床上将DR分为非增殖性DR（NPDR）和增殖性DR（PDR），前者无视网膜新生血管增生，而后者有视网膜新生血管增生，医学上认为NPDR是PDR的前期[3-5]。DR的致盲概率大，据统计约10%的DR患者会丧失视力。我国DM患病率逐年升高，因此，研究DR的发病机制与治疗方法具有重要意义。目前研究表明，DR的发生与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及对氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）的基因多态性有关[6]。VEGF能增强毛细血管的细胞通透性，促进血管增生，造成DM患者视网膜病变，而VEGF基因在转录过程中形成多种同分异构体，如VEGF121、VEGF165和VEGF206，其表达活性受游离mRNA控制[7-9]。人体内存在抗氧化和氧化机制，DM患者高血糖水平会促进机体的氧化作用，打破机体抗氧化/氧化平衡，产生氧化应激反应，生成更多的氧化剂破坏机体细胞、组织和器官，引起病变。而PON1蛋白表达产物能抑制氧化应激作用，当机体PON1基因表达抑制，细胞过氧化加剧，细胞的代谢作用受到影响，引起病变，并且氧化应激的正反馈作用会进一步加剧病变[10-11]。本研究以DM患者和体检健康者为研究对象，探讨VEGF、PON1基因多态性和DR的相关性，现将结果报道如下。

表1 各组血压及生化指标水平比较

a：P<0.05，与NC组比较；b：P<0.05，与NPDR组比较

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年1月至2015年12月于西宁市第二人民医院治疗的DM患者168例，男97例，女71例。入选者相互无血缘关系，且符合DM判定标准：空腹状态下血糖水平，静脉血浆大于7.5 mmol/L，静脉全血大于6.4 mmol/L，毛细血管全血大于6.3 mmol/L；服糖后2 h血糖水平，静脉血浆大于12.1 mmol/L，静脉全血大于10.9 mmol/L，毛细血管全血大于11.8 mmol/L。排除心脏病、肾衰竭、肝癌等疾病患者。将患者分为3组：单独DM组（DM组）48例，男28例，女20例，平均（62.51±9.31）岁；PDR组66例，男34例，女32例，平均（61.73±8.75）岁；NPDR组54例，男30例，女24例，平均（63.28±9.65）岁。另选取同期体检健康者104例纳入健康组（NC组），男55例，女49例，平均（60.91±9.81）岁。本研究获西宁市第二人民医院伦理委员会批准，患者或近亲属签署知情同意书。

1.2方法 测量并记录所有受试者血压、血脂及糖化血红蛋白水平。采集受试者空腹静脉血，提取基因组DNA后加入抗凝血清低温保存待用，采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）水平，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）水平。PCR引物序列：PON1 Q192R，引物1：5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′，引物2：5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；PON1 L 55M，引物1：5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′；引物2：5′-TTT ATT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3′。PCR反应条件：先94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min。

2 结 果

2.1各组血压及生化指标水平比较 与NC组比较，DM组、NPDR组及PDR组收缩压、糖化血红蛋白水平明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；其他各项指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。PDR组和NPDR组收缩压比较，差异有统计学意义（P<0.05），其余各项指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）,见表1。

2.2VEGF等位基因检测结果 未发生基因突变时，C等位基因是纯合型因子（CC），电泳结果呈现一条荧光带（208 bp）；纯合突变型等位基因（TT）电泳时产生122、86 bp两条片段；杂合型（CT）电泳出现208、122、86 bp 3条片段。VEGF等位基因基因型检测结果见图1。

图1 VEGF等位基因基因型检测结果

2.3不同基因型患者DR发生率 CC基因型DR发生率71.05%，CT基因型发生率为56.27%，TT基因型发生率仅38.64%。CC基因型患者DR发生率明显高于CT和TT基因型患者，差异有统计学意义（P<0.05）；而CT基因型患者DR发生率与TT基因型患者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4PON1等位基因检测结果 PON1基因型PCR实验扩增产物有3种，分别为99、66、33 bp 3种片段。QQ基因型患者仅有99 bp片段，RR基因型有66、33 bp片段，QR基因型有99、66、33 bp片段。PON1 192位点基因型检测电泳结果见图2。

2.5不同PON1 192位点基因型受试者体内SOD和MDA水平比较 PON1 192位点不同基因型体检健康者SOD和MDA水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；PON1 192位点不同基因型DR患者SOD和MDA水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），QQ基因型患者体内SOD水平低于其他两种基因型患者，MDA水平高于其他两种基因型患者，见表2。

表2 不同PON1 192位点基因型受试者体内SOD和MDA水平比较

a:RR基因；b：QQ基因；c：QR基因；d：对比基因
图2 PON1 192位点基因型检测结果

3 讨 论

DM是一种由于胰岛素分泌不足或胰岛功能缺陷导致血糖过高的代谢性疾病，长期高血糖会破坏各组织器官，眼、肾、血管的损伤尤为严重。DM对眼部损伤很大，可改变眼组织神经和血管循环，损伤眼部功能和视力[12]。微血管是一类介于微小动脉和微小静脉的毛细血管网，为血液提供物质交换和代谢的场所，而DM患者过高的血糖水平引起代谢紊乱，使血管内皮细胞损伤，从而破坏视网膜上皮细胞的联合，研究表明DR是致盲的主要原因之一[13]。出血斑点、黄斑水肿、视网膜微血管异常和棉绒斑等症状都是视网膜血管病变的临床表现，由视网膜微血管渗漏引起的缺血会使视网膜出血，严重时还会脱落，严重损伤视力[14-15]。

DM患者体内的高血糖环境会使蛋白激酶C的转录因子表达增多，这些转录因子作为分子信号促进VEGF基因的转录和翻译，使VEGF蛋白水平提升。另一方面，高血糖状态会破坏毛细血管红细胞的细胞膜组织成分从而使物质交换速率变缓，细胞供氧不足而发生缺氧，发生正反馈作用，促进VEGF蛋白表达。VEGF基因有3种基因型（CC、CT、TT），不同人体不同基因型的表达水平存在差异，基因突变对VEGF的表达产生影响。本研究表明，CC基因型患者DR发生率明显高于CT和TT基因型患者，差异有统计学意义（P<0.05），但CT基因型患者DR发生率与TT基因型患者比较无明显差异（P>0.05）。DR的发病率可能与CC和C等位基因频率升高及VEGF基因的高水平呈正相关。研究发现，PON1基因多态性与DR关系密切，PON1基因有3种基因型（QQ、QR、RR）。PON1 192位点基因促进DR发生但不影响DR的发展，PON1基因先通过控制PON1酶活性从而控制体内的氧化应激反应，氧化应激是机体摄取氧分子进行氧化反应的过程，如视网膜中的不饱和脂肪酸参与氧化应激。MDA水平可反映机体脂质氧化程度，SOD可反映机体氧自由基水平。本研究通过SOD和MDA水平衡量氧化应激水平，结果显示，QQ基因型患者体内SOD水平高于QR、RR基因型患者，MDA水平低于QR、RR基因型患者，说明QQ型患者体内氧化应激水平高。DR患者氧化应激水平明显高于健康体检者。

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Correlationbetweenvascularendothelialgrowthfactorandparaoxonase1genepolymorphismwithdiabeticretinopathy*

WeiQinfeng1，LiXianjia2

（1.DepartmentofOphthalmology,SecondPeople′sHospitalofXiningCity,Xining,Qinghai810003,China； 2.DepartmentofTibetanMedicine,MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810003,China）

ObjectiveTo explore the correlations of vascular endothelial growth factor （VEGF） and paraoxonase 1 （PON1） gene polymorphism with diabetic retinopathy.MethodsA total of 168 patients with diabetes mellitus（DM） in the Second People′s Hospital of Xining City were selected from January 2013 to December 2015,and were divided into the DM group （48 cases）,proliferative diabetic retinopathy （PDR） group （66 cases） and non-proliferative diabetic retinopathy （NPDR） group （54 cases）.A total of 104 healthy subjects were selected as the control group （NC group）.The VEGF and PON1 gene polymorphisms were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）,and levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） of all subjects were detected by using UV spectrophotometer.ResultsCompared with the NC group,the systolic blood pressures and glycated hemoglobin levels in the DM group,NPDR group and PDR group were significantly increased,there were statistically significant differences （P<0.05）.No statistically significant difference was found in diastolic blood pressure and levels of cholesterol,triglyceride,high density lipoprotein among these groups （P>0.05）.There was statistically significant difference in systolic blood pressure between PDR group and NPDR group （P<0.05）,while no statistically significant difference was found in diastolic blood pressure and levels of cholesterol,triglyceride,high density lipoprotein and glycated hemoglobin between the two groups （P>0.05）.The incidence rate of DR in the patients with CC,CT and TT genotype was 71.05%,56.27% and 38.64%,respectively.The incidence rate of DR in the patients with CC genotype was significantly higher than that in the patients with CT or TT genotype （P<0.05）.No statistically significant difference was found in SOD and MDA levels of healthy subjects with different PON1 192 genotypes （P>0.05）.The SOD level of DR patients with QQ genotype was lower than that of patients with QR or RR genotype,and the MDA level of DR patients with QQ genotype was higher than that of patients with QR or RR genotype,the difference was statistically significant （P<0.05）.ConclusionThe expression of VEGF and PON1 genes could affect the development and progression of DR.PON1 gene might control the progression of DR by affecting the expression of oxidative kinase in DR patients.

vascular endothelial growth factor；paraoxonase 1；polymorphism，single nucleotide；diabetic retinopathy

国家自然科学基金资助项目（81560806）。

卫钦锋（1970-），副主任医师，本科，主要从事眼科临床研究。

R774.1

A

1671-8348（2017）30-4223-03

2017-04-18

2017-06-26）