暗黑鳃金龟幼虫生防黄绿绿僵菌Ma130821菌株的室内培养条件的研究

刘思雨，杜广祖，户艳霞，王新中，肖关丽*，陈 斌*

(1.云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201；2.云南省烟草公司大理州烟草公司，云南大理 671000)

暗黑鳃金龟幼虫生防黄绿绿僵菌Ma130821菌株的室内培养条件的研究

刘思雨1*，杜广祖1*，户艳霞2，王新中2，肖关丽1**，陈 斌1**

(1.云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201；2.云南省烟草公司大理州烟草公司，云南大理 671000)

从云南省玉溪市塔甸镇玉米地自然罹病的暗黑鳃金龟幼虫僵虫上分离纯化获得了黄绿绿僵菌Ma130821，为了弄清该菌株培养条件，为蛴螬生物制剂开发应用提供依据，本研究在室内测定了该菌株在PDA和SDAY培养基上的生长繁殖情况及在不同pH、温度、光照条件下培养特征及产孢特性。结果表明：黄绿绿僵菌Ma130821菌株在PDA和SDAY两种培养基上均能生长，但在PDA培养基上产孢时间早于SDAY，其中在PDA和SDAY培养基上分别于第6天和9天开始产孢。在25℃时生长最好，平均直径日增量为0.24 cm/d，第4天时就开始产孢且产孢量最高，为1.091×107孢子/cm2。在16 L ∶8 D的光周期条件下菌落生长最快，产孢时间最早，且产孢量最大。pH 6.5最适宜该黄绿绿僵菌菌株的生长及产孢。综合以上结果，PDA培养基可用于黄绿绿僵菌Ma130821菌株的室内培养，最适培养条件为pH 6.5、25℃、16 L ∶8 D。该研究结果将为蛴螬生防黄绿绿僵菌Ma130821制剂的开发提供依据。

黄绿绿僵菌；培养条件；菌落生长；产孢时间；产孢量

蛴螬是鞘翅目金龟甲总科幼虫的总称，种类多、生活周期长、食性杂、分布广、危害隐蔽，防治困难，是农林作物和植物重要的地下害虫(张芝利，1984)。近年来，随着种植结构的调整、作物布局的改变，蛴螬的发生危害日趋严重。长期以来应用化学农药防治蛴螬，虽然也降低了虫量与为害率，但农药残留不仅易使蛴螬产生抗药性，而且会造成水土环境污染，农产品农药残留(姚庆学等，2003)。由此，利用微生物防治蛴螬已成为绿色植保及生态农业发展的重要途径(林华峰等，2006)。目前，白僵菌(李兰珍和宋友发，1998；赵文琴等，2005；林华峰等，2006)和绿僵菌(陈祝安等，1995；陈斌等，2003；林华峰等，2006；程辉彩等，2007；陈斌等，2010；申剑飞等，2012)对蛴螬的室内毒力及田间应用试验都已有一些研究报道。

黄绿绿僵菌Metarhiziumflavoviride属半知菌类丛梗菌目丛梗霉科绿僵菌属，在田间自然条件下能侵染褐飞虱(Rombachetal., 1986)、水稻二化螟ChilosuppressalisWalk(刘爱英，1990)、蝗虫(Thomasetal., 1996)，对马铃薯叶甲也具有良好的毒力(郭艳琼和李友莲，2007)，主要用于蝗虫的防治(Thomasetal., 1996; Milner, 1997)。而对于侵染蛴螬的黄绿绿僵菌菌株及其应用的系统研究还未见有报道。

绿僵菌菌株具有一定的地理特异性及寄主专化性，不同地理环境、不同寄主来源的绿僵菌菌株在菌落形态、营养需求、寄主专一性等方面存在明显差异(孙家宝等，2007；Ansari etal., 2009；苏宇等，2010)。因此，筛选适合虫生真菌菌株生长、繁殖的条件是害虫生防优良绿僵菌菌株筛选及开展害虫生物防治的基础。本研究以自然条件下在玉米田蛴螬种群中发生流行很强的一株绿僵菌为研究对象，通过对其菌落生长状况、培养条件(培养基种类、pH值、温度、光照)等生物学特性的研究，筛选出对其菌落生长及产孢最佳的培养基种类、pH值、温度、光照等条件，为利用该菌株生物防治蛴螬提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从云南省玉溪市峨山县塔甸镇(24°14′34.66″N，102°12′40.75″E，海拔1796 m)玉米田采集罹病暗黑鳃金龟HolotrichiaparallelaMotschulsky幼虫，在室内用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基进行分离培养，纯化后在4℃冰箱中保存。

1.2 供试培养基

萨氏葡萄糖琼脂酵母浸膏(SDAY)培养基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉10 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 mL(蒲蛰龙和李增智，1996)。PDA培养基：去皮马铃薯块200 g煮汁过滤，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL(蒲蛰龙和李增智，1996)。

1.3 试验方法

1.3.1培养基对Ma130821菌株生长与产孢的影响

选择SDAY和PDA培养基，将菌株采用点接法分别接种至2种培养基(90 mm)中央，每个处理重复3次。然后放入25±1℃的光照培养箱中，黑暗条件下培养，每天观察菌落直径，从第4天开始测量，直至产孢结束。

产孢量的测定。用直径6 mm的打孔器从每一菌落的中心点至边缘距离的1/2处打孔截取小菌块，每皿5个重复。然后放入含0.05%吐温-80、20 mL无菌水的三角瓶中，磁力搅拌10 min，打散孢子团，获孢子悬浮液。用微量移取器从三角瓶吸取孢子悬浮液，滴在血球计数板上，以10倍进行稀释至血球计数板可数为止，在显微镜下观察计数，计算每种培养基上单个菌落的平均产孢量，选择生长状况最好的培养基进行下面的实验(杨新军等，2007)。

1.3.2温度对Ma130821菌株生长及产孢的影响

选取1.3.1中筛选的最适培养基，灭菌后冷却至50℃左右，将每个处理所需的15 mL培养基倒于直径90 mm灭菌培养皿中，分别在5、10、15、20、25和30℃条件下培养，每个处理重复3次。

用少量含0.5 mL/L吐温-80的无菌水洗下斜面绿僵菌分生孢子，放入盛有200 mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，振荡，打散孢子团块。无菌下用微量移取器从三角瓶吸取孢子悬浮液滴于上述已标记的平板中央，将平板静20 min后，倒置，然后放入上述不同温度的光照培养箱中，不开启光照灯，黑暗自然培养，每天观察，从第4天开始进行测量菌落直径，直至产孢结束，测量方法同1.3.1。菌落生长至孢子变绿后，进行孢子计数，方法同1.3.1，筛选选出最适温度。

1.3.3光照对Ma130821菌株生长及产孢的影响

采用1.3.2中筛选出的最佳温度进行实验。分别将光照培养箱的光照时间设置为L ∶D=24 ∶0、L ∶D=16 ∶8、L ∶D=12 ∶12、L ∶D=8 ∶16、L ∶D=0 ∶24共5个光周期处理(侯颖等，2015)，每个处理3次重复。接种方法同1.3.2。每天观察，第4天开始测量菌落直径，测量方法同1.3.1，直至产孢结束。菌落长到第12天，菌落表面的分生孢子变为绿后，进行孢子计数，方法同1.3.1，确定最佳光照时间。

1.3.4pH值对Ma130821菌株生长及产孢的影响

选取最适培养基，灭菌前用10%HCl溶液和10%NaOH溶液将培养基调成4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的pH值(殷幼平等，2010)。将灭菌的不同pH的培养基约15 mL分别倒于直径90 mm的灭菌培养皿中，置于25℃条件下培养，每个处理重复5次。接种方法同1.3.2。每天观察，第4天进行测量菌落直径，测量方法同1.3.1，直至产孢结束。菌落长到第12天，孢子变为绿色后，计数孢子数量，方法同1.3.1，筛选最适pH。

1.3.5数据处理

菌落直径=(菌落横径+菌落纵径)/2；菌落直径日增长量(cm/d)=平均菌落直径/培养天数；每cm2菌落含孢量=平均每小格孢子数×400×104×稀释倍数/(3.14×0.32)(王萍莉，2006)；每mL孢子总量=80小格内孢子总数/80×400×104×稀释倍数。

实验数据利用SPSS 20.0软件进行处理、分析。

2 结果与分析

2.1 培养基对Ma130821菌株生长及产孢的影响

菌落生长结果表明，黄绿绿僵菌Ma130821在PDA和SDAY两种培养基上均能生长，菌落平均直径日增量分别为0.21和0.20 cm/d，二者间无明显差异(F=0.13，P>0.05)；在两种培养基上培养至第12天时菌落直径分别为2.45和2.26 cm，二者间无明显差异(F=0.11，P>0.05)(图1)。

图1 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在2种培养基上的菌落直径变化(cm)Fig.1 The diameter change of colony of Ma130821 on two culture mediums

从产孢时序来看，黄绿绿僵菌Ma130821菌株在PDA培养基上产孢时间早于SDAY上，其中在PDA和SDAY培养基上分别于第6天和9天开始产孢，在PDA培养基上的最初产孢时间明显短于在SDAY培养基(F=8.57，P<0.05)。

从产孢量来看，黄绿绿僵菌Ma130821菌株在PDA和SDAY培养基上的产孢量间无明显差异(F=2.38，P>0.05)，分别为1.49×106孢子/cm2和1.12×106孢子/cm2。

2.2 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同温度下的生长及产孢特性

黄绿绿僵菌Ma130821菌株在15℃-30℃内均能生长(图2)，但在不同温度下菌落生长速率不同，且随温度的升高而增加，在30℃条件下菌落生长速率降低。在20℃-25℃条件下的菌落直径增长速率明显高于其它温度范围，其中在25℃时生长最好，平均直径日增量为0.24 cm/d，第12天时菌落直径达2.63 cm，显著高于其他温度下的菌落直径。其次为20℃，平均直径日增量为0.18 cm/d，第12天时菌落直径达2.37 cm；而>25℃或≤15℃时生长较慢，30℃下绿僵菌孢子前期生长较15℃快，菌落直径显著大于15℃下的直径，而到培养后期以15℃下增长较快，<10℃时菌株则停止生长。

图2 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同温度下的菌落直径变化(cm)Fig.2 The colony diameter change of Ma130821 under the different temperatures

从黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同温度下的产孢时序(表1)来看，在15℃、20℃、25℃、30℃下该菌株均能产孢。其中25℃为菌株最佳产孢温度，其产孢时间最早，第4天时就开始产孢且产孢量最高，为1.091×107孢子/cm2，显著高于其他温度下的产孢量；其次为20℃，从第5天开始产孢，产孢量达4.60×106孢子/cm2，也显著高于15、30℃下的产孢量；当温度≤15℃或>25℃时初始产孢时间较晚、产孢量较少，分别从第8天和第10天才开始产孢，较最早产孢时间晚6-8 d，产孢量分别为1.47×106孢子/cm2和1.87×106孢子/cm2，两者差异不显著(F=0.4820，P>0.05)；在≤10℃条件下，菌株无明显的生长和产孢。因此，该菌株的生长最适温度为25℃。

2.3 光照对黄绿绿僵菌Ma130821菌株菌落生长及产孢的影响

黄绿绿僵菌Ma130821菌株在8 L ∶16 D、12 L ∶12 D、16 L ∶8 D和24 L ∶0 D的光周期下均能生长(图3)，但在不同光周期下菌株的生长速率不同。在24 L ∶0 D、16 L ∶8 D和12 L ∶12 D三种光周期条件下的生长速率较高于其它光周期，其中以16 L ∶8 D光照下的菌落直径最大，第12天时菌落直径达2.75 cm，平均直径日增量为0.24 cm/d；其次为24 h光照，菌落直径达2.50 cm，平均直径日增量为0.24 cm/d；12 L ∶12 D光周期下的菌落直径达2.47 cm，平均直径日增量为0.24 cm/d。以上三种光周期下的生长速率均显著高于其他光周期下的菌落生长，但三者间无明显差异(F=0.13，P>0.05)。

从不同光周期下Ma130821菌株的产孢特征(表2)可以看出：菌落在16 L ∶8 D、12 L ∶12 D、8 L ∶16 D光周期及全黑暗、全光照环境下均能产孢，但初始产孢时间和产孢量不同：16 L ∶8 D下产孢时间最早，而且产孢量最高达1.003×107孢子/cm2。其次为12 L ∶12 D光周期，在该条件下于第3天开始产孢，产孢量达9.02×106孢子/cm2；L ∶D=24 h ∶0 h下从第4天开始产孢，产孢量达7.84×106个/cm2，均极显著高于8 L ∶16 D的产孢量，但三者间无明显差异。8 L ∶16 D与L ∶D=0 h ∶24 h条件下产孢较快，但产孢量少，两者间无差异(F=0.8120，P>0.05)。

表1 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同温度下的生长情况

注：数据为平均数±标准误，数据后的小写字母表示差异达5%显著水平，大写字母表示差异达1%显著水平。Note: Data are mean±SE. Data followed by different lower case letters indicate significant difference at 0.05 level and different upper case letters indicate significant difference at 0.01 level.

图3 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同光周期下的菌落直径(cm)Fig.3 The diameter of colony of Ma130821 under the different photoperiods

表2 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同光周期下的生长情况

注：数据表示方法同表1。Note: The representations of data were similar to table 1.

根据以上结果，黄绿绿僵菌Ma130821在16 L ∶8 D的光周期条件下菌落生长最快，产孢时间最早，且产孢量最大。由此表明，黄绿绿僵菌Ma130821菌落生长与产孢的最佳光周期为16 L ∶8 D。

2.4 pH值对黄绿绿僵菌Ma130821菌株生长及产孢的影响

黄绿绿僵菌Ma130821菌株在pH值4.5-7.0的培养基上均可生长(图4)，但在pH值为6.0-7.0时，菌落生长较好，接种后培养到第8天时pH 6.5培养基上的菌落直径显著高于其他pH下的菌落直径，但从第9天开始，菌落生长速率开始降低。pH 7.0时菌落直径日增长量较大，菌落直径也最大，但与其他pH下的菌落直径间无明显差异。从整个培养过程来看，该菌株以pH 6.5和pH 7.0时菌落平均直径日增量分别为0.23 cm/d和0.22 cm/d，而在pH 4.5时菌落生长较为缓慢，平均直径日增量仅为0.19 cm/d。

图4 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同pH下的菌落直径(cm)Fig.4 The diameter of the colony of Ma130821 at different pHs

黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同pH下的产孢时序结果表明(表3)，pH 4.5-7.0均能产生分生孢子，在pH 6.5条件下产孢最早，第2天开始产孢；其次是在pH 6.0下从第3天开始产孢；pH 5.5和pH 7.0下，均从第4天开始产孢；pH 4.5下产孢时间最晚，第6天才开始产孢。从产孢量来看，黄绿绿僵菌Ma130821菌株在pH 6.5条件下产孢量最高，为8.67×106孢子/cm2；其次为pH 7.0，产孢量为7.90×106孢子/cm2；pH 6.0条件下产孢量为6.96×106孢子/cm2，但pH 6.0-7.0下的产孢量间无明显差异；pH 4.5下产孢量最少，仅为2.77×106孢子/cm2。

表3 黄绿绿僵菌Ma130821菌株在不同pH下的生长情况

注：数据表示方法同表1。Note: The representations of data were similar to table 1.

由此表明，pH值对黄绿绿僵菌Ma130821菌落的生长具有明显的影响，其中pH 6.5最适宜该黄绿绿僵菌菌株的生长及产孢。

3 结论与讨论

虫生真菌常用来分离培养的培养基主要有PDA和SDAY培养基，本研究中分离自蛴螬的黄绿绿僵菌Ma130821在PDA上除产孢时间较早外，生长速率、产孢量与在SDAY培养基上均无显明差异。李佳颖等(2013)研究发现分离自土壤样品的黄绿绿僵菌菌株SM076在PDA培养基上生长速度、产孢量均显著高于SDAY培养基。而张松影等(2011)研究发现从罹病褐飞虱虫体上新分离出的一种黄绿绿僵菌菌株MetarhiziumflavovirideMf82菌株在SDAY培养基上生长最快，菌落增长率最大，产孢量也最大(张松影等，2011)，但在PDA培养基上菌落直径增长缓慢、产孢量小，不适合Mf82菌株生长与繁殖。造成这种差异的原因可能是由于菌株寄主来源的差异，但还有待于进一步研究。

温度、光照及培养基pH是影响虫生真菌菌株生长、产孢时间和产孢量的重要因素。本研究发现，黄绿绿僵菌菌株Ma130821生长最适温度为25℃，最适pH 6.0，与张松影等(2011)发现分离自褐飞虱Nilaparvatalugens的黄绿绿僵菌mf82菌株的生长最适温度条件相同，但与李佳颖等(2013)发现的分离自华南地区土壤样品中的黄绿绿僵菌SM076菌株生长繁殖最适温度条件不同。此外，从光照条件来看，本研究中该菌株Ma130821生长最适的光照条件为16 L ∶8 D，这与张松影等(2011)报道的mf82菌株的光照条件不同，究其原因可能与地理来源及寄主来源有关，但具体原因还有待进一步研究。

绿僵菌作为一种传统的虫生真菌，在害虫种群的自然控制中具有重要作用(蒲蛰龙和李增智，1996)，黄绿绿僵菌在蝗虫的生物防治中发挥了重要作用(Thomasetal., 1996; Lomeretal., 1997; Milner, 1997)。本研究中发现的菌株分离自玉米田暗黑鳃金龟幼虫，在玉米田暗黑鳃金龟幼虫种群中具有很强的流行性，且对培养条件的要求不是很苛刻，因此对暗黑鳃金龟生防制剂的开发具有良好潜力。黄绿绿僵菌的生长和生殖不仅受到环境温度的影响，而且还需要一定的营养物质。其中碳水化合物、氮素和矿物质作为黄绿绿僵菌生长发育的主要营养物质，Jenkins等(1994)研究发现分离自Acridoidae hosts的几株黄绿绿僵菌的产孢受碳源(蔗糖)和氮源(酵母膏)的影响较大，发现适合的配方为蛋白胨5 g、蔗糖30 g、马铃薯200 g、琼脂20 g和水1000 mL。而李佳颖等(2013)研究发现分离自华南地区土壤的黄绿绿僵菌SM076菌株以淀粉作为碳源的PDA培养基上生长最快、产孢量最高。本研究尚未对碳源及氮源对该黄绿绿僵菌菌株生长繁殖及产孢的影响进行研究，为了对该菌株进行开发应用，这也将是下一步值得深入研究的内容。

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StudyonthecultureconditionforthebiocontrolstrainMa130821ofMetarhiziumflavovirideagainstthechaferofHolotrichiaparallela

LIU Si-Yu1*, DU Guang-Zu1*, HU Yan-Xia2, WANG Xin-Zhong2, XIAO Guan-Li1**, CHEN Bin1**

(1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan, College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Dali Tobacco Company, Dali 665000, Yunnan Province, China)

The biocontrol strain Ma130821 ofMetarhiziumflavoviridefor pest insect was isolated from the chafer ofHolotrichiaparallelaMotschulsky in corn field in Tadian town of Yuxi city, Yunnan Province. A study on the culture conditions for the stain Ma130821 was conducted in laboratory in order to research and develop biological control agents for chafers. The growth and sporulation of Ma130821 was tested on different culture medium under different pHs, temperature and photoperiods. The results showed that the strain Ma130821 can be cultured on PDA and SDAY medium, but the sporulation on PDA was earlier than on SDAY, which was on the 6thday after the culture. The optimal temperature for the growth of Ma130821 on PDA medium was at 25℃, the daily increase rate of colony diameter was 0.24 cm/d, it produced spores on the 4thday after the culture and with a maximum sporulation of 1.091×107spores/cm2. The most rapid growth rate of colony, the earliest and the greatest sporulation was at the photoperiod of 16 h light and 8 h darkness. The optimal pH for the growth of Ma130821 was pH 6.5. Based on the above results, the PDA medium is suitable for the culture of Ma130821, the optimal condition for its growth and development was pH6.5, 25℃ and 16 h photoperiod. All the results will provide a theoretical base for the development of biological control agents for chafers.

Metarhiziumflavoviride; culture condition; colony growth; sporulation time; sporulation number

刘思雨，杜广祖，户艳霞,等.暗黑鳃金龟幼虫生防黄绿绿僵菌Ma130821菌株的室内培养条件的研究[J].环境昆虫学报，2017,39(5):1007-1014.

Q965;S476

A

1674-0858(2017)05-1007-08

云南省烟草公司科技计划项目(2014YN16)；国家自然科学基金项目(31660537)；云南省农业生物多样性利用与保护省部共建国家重点实验室学生科技创新创业行动基金项目(ZBPG03)

刘思雨，男，1991年生，陕西扶风县人，硕士研究生，研究方向为害虫综合防治研究，E-mail：779350009@qq.com

*共同第一作者, E-mail: 15288457381@163.com

**通信作者Author for correspondence, E-mail: chbins@163.com; glxiao9@163.com

Received: 2016-12-01; 接受日期Accepted: 2017-04-23