4株南极真菌的形态学和分子鉴定及其中3株的蛋白磷酸酶、脂肪酸成分分析

黄金昌，田晓清，樊成奇，乔玉宝，唐莹莹马丽艳，陆亚男，杨 桥，黄洪亮

4株南极真菌的形态学和分子鉴定及其中3株的蛋白磷酸酶、脂肪酸成分分析

黄金昌1，2，田晓清1，樊成奇1，乔玉宝1，2，唐莹莹1，2马丽艳1，陆亚男1，杨 桥1，黄洪亮1

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学，上海 201306）

由于极地独特的地理、气候及环境特点，使得极地微生物及其代谢产物具有新颖性与多样性。采用3种选择性培养基的稀释平板涂布法，从南极普里兹湾海洋沉积物中分离得到4株真菌菌株，经过形态学、18s rDNA-ITS序列分析，分别鉴定为隐球酵母 Cryptococcus sp.NJF1、曲霉 Aspergillus sp.NJF3、枝孢霉Cladosporium sp.NJF4和Cladosporium sp.NJF6；对其中的曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6等3株真菌开展了蛋白磷酸酶含量和大田软海绵酸OA对该酶的抑制作用测试，并分析了菌株提取物中的脂肪酸成分。结果显示：NJF3、NJF4和NJF6有很好的蛋白磷酸酶活性，以蛋白磷酸酶-PP为外标，测定酶含量分别为0.732 2 U·g－1、0.678 U·g－1和1.229 2 U·g－1，且100 nM OA对 NJF3和 NJF4蛋白磷酸酶有一定抑制作用，而 NJF6需要200 nM OA才可以轻微抑制其蛋白磷酸酶活性；3株真菌的脂肪酸成分以油酸为主，相对含量分别达到32.4%、37.2%、40.1%，而NJF4和NJF6还含有较高含量的亚油酸，相对含量分别达到 27.3%、29.8%。本研究可为下一步开展菌株的酶、天然代谢产物研究奠定基础。

极地微生物；Aspergillus sp.；Cladosporium sp.；蛋白磷酸酶；脂肪酸

南极具有独特的地理及气候特征，除在短暂的夏季部分地区有冰雪融化外，其余地区均常年被冰雪所覆盖。变化极大的光照辐射、季节性的光照时间、极低的温度孕育了特殊的生物多样性，而特殊的生物多样性往往孕育着特殊的化学多样性和生物活性的多样性［1］。据不完全统计，南极大陆已发现大约251个真菌种，其中有至少20个为新种，约占8%，显示了南极真菌的多样性和新颖性［2］。

蛋白磷酸酶是一类调控酶，它主要选择性地对细胞内蛋白的一些氨基酸磷酸化位点进行去磷酸化，从而与蛋白激酶共同调控细胞内蛋白翻译后的磷酸化修饰水平，在细胞内的信号转导、细胞循环、次生代谢产物及底物的转化过程中起着非常重要的作用［3－6］。而脂肪酸作为微生物一类重要的代谢产物，其组成分析将为菌株代谢产物的深入研究奠定基础。本研究对4株来自南极普里兹湾海域海泥的真菌进行了分类鉴定，并对其中3株曲霉和枝胞霉进行了蛋白磷酸酶含量和大田软海绵酸OA对该酶的抑制作用测试，分析了菌株提取物中的脂肪酸成分，以期为下一步开展菌株的酶、天然代谢产物研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品和处理器材

1.1.1 样品来源

南极海洋沉积物来自中国第29次南极科学考察普里兹湾海域，站位 78°0.6′E、66°56′S。

1.1.2 仪器与试剂

高压灭菌器（上海申安医疗器械厂，LDZX-75KBS型）；微生物恒温培养箱（上海一恒科学有限公司，DHP 9162A型）；大型恒温培养箱（Shanghai Chemstar Instruments Co Ltd，ATB-032型）；超净工作台（北京东联哈尔仪器有限公司，DL-CJ-INDII型）；台式高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司，H-1560型）；超声波清洗器（上海汉克科学仪器有限公司，SK250LH型）；PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司，AG-22331型）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，GIS-1600型）；显微镜（上海光学仪器一厂，XSP-44X.9型）；酶标仪（TECAN，SPARK 10M型）。

试剂：真菌DNA小剂量快速提取试剂盒（上海生工生物公司）；18s引物（上海迈浦生物公司）；PCR扩增体系（康为世纪）；其它试剂均为国药集团分析纯。HP-20大孔吸附树脂（Mitsubishi Chemical Ltd，Japan）；凝 胶 Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech，Sweden）；预制 GF254 TLC硅胶板（青岛海洋化学公司）；液相用乙腈（色谱级，Tedia，USA）；其余溶剂均为分析纯（AR，上海国药集团）。

1.1.3 培养基和缓冲液

分离培养基：孟加拉红固体培养基（蛋白胨5.0 g，葡萄糖 10.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，硫酸镁0.5 g，琼脂 20.0 g，1／3000孟加拉红溶液 100 mL，陈海水1 000 mL）［8］；PDA固体培养基（马铃薯 200.0 g，葡萄糖 10.0 g，琼脂 18.0 g，陈海水1 000 mL）；YPD固体培养基（酵母膏 10.0 g，蛋白胨20.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，陈海水1 000 mL）。用于分离菌株时每种培养基添加氯霉素和萘啶酮酸各30 U·mL－1，pH 6.0～6.5［9］。

发酵培养基：YPD液体培养基。

缓冲溶液（A溶液）：30 mmol·L－1Tris-HCl，2 mmol·L－1EDTA，20 mmol·L－1MgCl2缓冲溶液，pH 8.4，4℃冷藏；BSA溶液（B溶液）：用A溶液配制 0.2 mg·mL－1的 BSA溶液（含 2 mmol·L－1DTT），4℃冷藏；测试溶液（C溶液）：用B溶液配制25 mmol·L－1p-NPP溶液，作为底物溶液，避光保存［7］。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离

称取1 g左右南极土壤样品加入到10 mL无菌水中，震荡混匀后静置于4℃培养箱中过夜，将样品悬液做梯度稀释为 10－1、10－2、10－3、10－4。10－3和10－42个梯度分别取 100μL涂布于孟加拉红固体培养基、PDA固体培养基和YPD固体培养基上，每个样品做3个平行。将平板放于27℃培养箱中倒置培养。培养约1～2周后待培养基生长出真菌菌落，根据菌落形态、所产色素颜色、干燥性等特征挑取形态差异较大的真菌，及时转移到相应的新鲜培养基上划线分离纯化。为了得到纯菌落，分离纯化步骤至少进行3次。分离得到的菌株暂时保存于YPD培养基斜面，4℃冰箱备用。

1.2.2 菌落形态观察

将纯化菌株接种在新鲜YPD培养基平板，于27℃倒置培养7～10 d，观察并记录菌落大小、颜色、质地、有无分泌物等特征［10］。载玻片上滴一滴清水，刮取少量菌丝体和孢子在清水中分散均匀，盖上盖玻片。于光学显微镜10×40倍下观察菌丝形状、大小等特性及孢子的外形、颜色。仔细观察并记录［11］。

1.2.3 r DNA-ITS序列分析

将真菌液体发酵液减压抽滤浓缩得菌丝体，取适量菌体于研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状［12］。使用真菌DNA小剂量快速提取试剂盒提取真菌基因组DNA，并于－20℃保存备用。采用 18S-EF3：TCCTCTAAATGACCRAGTTTG 和18S-EF4：GGAAGGGRTGTATTTATTAG，扩增真菌18 s r DNA-ITS序列。

PCR扩增体系为50μL∶2×Taq PCR Master Mix 25μL，引物各2μL，模板 DNA 5μL，重蒸水16μL。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min［13］。取5μL PCR扩增产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶，100 V电泳30 min，检测 DNA大小，然后用凝胶成像分析系统拍照。基因组DNA－20℃保存统一送上海生工生物工程有限公司测序。

测得的序列在Genbank库与已有的序列进行在线同源比对，选取指标靠前、分类比较相近的种属序列8～10个，利用ClustalW多序列比对分析［14］，寻找基因突变位点。应用 MEGA 6.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）对 NJF3、NJF4、NJF6构建系统发育树，自展法检测发育树，自展数据集为1 000次，根据系统发育树中组群关系对菌株进行分类［15］。

1.2.4 蛋白磷酸酶活性筛选［7］

本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定蛋白磷酸酶酶活。p-NPP是无色或稍带黄色的结晶固体，在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，对硝基苯酚在强碱性条件下呈醌式结构而显示亮黄色，在405 nm处有强烈的吸收峰。

取0.5 g菌丝体（取1.2.3中粉末状菌丝体）加入3 mL B溶液。超声30 min，15 000转离心1 h。在96孔微孔板中加入样品液，然后快速加入底物溶液（总体系200μL）。

测试组：125μL原液＋25μL BSA缓冲液＋50μL底物。

NJF3和NJF4抑制组：125μL原液 ＋23μL BSA缓冲液＋50μL底物＋2μL OA，体系中OA终浓度100 nM。

NJF6抑制组：125μL原液＋21μLBSA缓冲液＋50μL底物＋4μLOA，OA终浓度200 nM。

空白组：150μLBSA缓冲液＋50μL底物。

按时间梯度，使用酶标仪每隔15 min测试、记录405 nm处的OD值［16］，作时间t-OD值关系图。

1.2.5 3株真菌油脂的提取

分离鉴定为曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的3株真菌各取发酵液1 L，分别按照如下流程提取油脂成分：减压过滤得上清液和菌丝体；菌丝体在超低温冰箱－80℃冷冻12 h，取出后迅速加入0.2 L乙酸乙酯，超声提取0.5 h，减压过滤得到提取液，重复提取3次；上清液用0.2 L乙酸乙酯萃取3～4次，收集乙酸乙酯液；合并全部乙酸乙酯液并减压蒸馏得总油脂部位。因总油脂极性成分较多，不易溶解于正己烷，无法按照食品的脂肪酸分析方法进行有效的前处理，因此分别将3株真菌总油脂部位溶解于50 mL 80%的甲醇溶液，加500 mg氢氧化钾水解过夜，然后加1M的稀盐酸中和到pH 7.0，加30 mL石油醚（60～90℃）萃取3次，合并石油醚萃取液并减压蒸馏，分别得曲霉NJF3油脂0.5 g、枝孢霉NJF4油脂0.7 g和 NJF6油脂 0.6 g。

1.2.6 3株真菌油脂的分析

分别称取3株真菌的油脂约300 mg，按照GB／T 17376－1998动植物油脂标准进行脂肪酸甲酯制备，再按照GB／T 17376－1998动植物油脂标准进行脂肪酸甲酯的气相色谱分析；各脂肪酸组分的相对含量以面积归一法计算得出。待测样的衍生制备、GC-MS测试及含量计算均由上海市食品研究所检测中心完成。

2 结果与分析

2.1 真菌的鉴定

2.1.1 形态学观察

菌株NJF1、NJF3、NJF4和NJF6的菌落、菌丝体特征见图1、图2，特征描述见表1。

表1 4株南极真菌的菌落、菌丝体特征［17－18］Tab.1 Characteristics of colony and mycelium of 4 strains fungus

图1 4株南极真菌的菌落照片Fig.1 Photos of 4 strains fungus colony

图2 4株南极真菌的显微照片Fig.2 Microphotographs of 4 strains fungus colony

2.1.2 rDNA-ITS分析

PCR扩增18s r DNA并测序，所得序列与Genbank数据库进行同源性比对，4株菌分属于3个属，分别为 Cryptococcus sp.、Aspergillus sp.、Cladosporium sp.。序列 ClustalW比对分析后［19］，结果见图3。

比对发现，Cryptococcus antarcticus（AB032630）菌株在667位由C突变为T，1566位由G突变为A；Cryptococcus bhutanenais（AB032620）菌株在699位由C突变为T。NJF1菌株与Genbank库的菌株高度同源，结合形态学特征可确定为隐球酵母 Cryptococcus sp.NJF1。

由构建的系统发育树可知，与菌株NJF3序列同源性较高的是曲霉Aspergillus versicolor（GU227343），相似度为 73%；NJF3与 Aspergillus silvaticus（AF548067）和 Aspergillus flavus（D63696）相似度也很高。结合形态学特征，确定为曲霉Aspergillus sp.NJF3。与菌株NJF4和NJF6同源性较高的分别是枝孢霉Cladosporium sphaerospermum （KJ443070）和 Cladosporium allicinum（AY251096），且这两株菌的序列同源性很高。结合形态学特征，确定为枝孢霉Cladosporium sp.NJF4和 Cladosporium sp.NJF6。

图3 菌株NJF1多序列比对分析Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of strains NJF1

图4 菌株NJF3、NJF4和NJF6构建系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree for strains NJF3，NJF4 and NJF6

2.2 株真菌的蛋白磷酸酶活性

以对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物，分别测定曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的蛋白磷酸酶酶活，反应进程见图5。

图5 NJF3、NJF4和NJF6蛋白磷酸酶酶活反应进程图Fig.5 Enzyme reaction process diagrams of NJF3，NJF4 and NJF6

由图5可知，NJF3菌株和NJF4菌株的酶反应缓慢，在测试时间内呈不断上升趋势。该两株菌抑制组OD值略低于原液组，可知100 nM OA对它们的蛋白磷酸酶有轻微抑制作用。NJF6菌株的酶反应迅速，体系的OD值45 min时达到3.50，之后不再发生明显变化，可知反应到达终点。OA是选择性的蛋白磷酸酶抑制剂［20］，对蛋白磷酸酶不同亚型的抑制活性有较大差异，对PP1、PP2A的 IC50分别为 312、1.2 nM。3株真菌中的蛋白磷酸酶可能具有一定的结构性能差异，因此OA对它们表现出不同的作用效果。

为测定各菌株蛋白磷酸酶含量，选取蛋白磷酸酶λ-PP作为外标，在反应时间30 min点采集不同浓度的 λ-PP蛋白磷酸酶（4、8、12、16、20 U）OD值，作吸光度-酶含量标准曲线（图6）。

图6 λ-PP蛋白磷酸酶反应进程30 min标准曲线图Fig.6 Standard curve of proteinλ-PP phosphatase reaction at 30 min

在反应时间为30 min点采集不同菌株原酶液及原酶液＋不同浓度OA的去磷酸化反应体系的OD值，根据标准曲线计算3株真菌原酶液及原酶液＋不同浓度OA后的蛋白磷酸酶含量。数据结果（表2）表明：NJF3、NJF4和 NJF6均含有不同量的蛋白磷酸酶，且菌株NJF6含量最高，为1.229 2 U·g－1；100 nM OA对 NJF3和 NJF4磷酸酶反应有一定抑制作用，尤其是NJF3菌株的抑制组蛋白磷酸酶含量为0.679 2 U·g－1菌体，相比原液组下降较为明显，而NJF6菌株需要200 nM OA才可以轻微抑制其蛋白磷酸酶活性。

表2 菌株NJF3，NJF4和NJF6蛋白磷酸酶含量Tab.2 Protein phosphatase content of strains NJF3，NJF4 and NJF6

磷酸化是细胞内蛋白翻译后修饰的主要途径之一［21］，真菌菌株 NJF3、NJF4和 NJF6的蛋白磷酸酶测试结果为后续尝试利用表观遗传学方法调控菌株的代谢过程［22］，即利用蛋白磷酸酶抑制剂影响菌株细胞内蛋白翻译后的磷酸化修饰水平，进而影响次级产物多样性奠定了基础。

2.3 3株真菌的脂肪酸组成

曲霉NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的油脂分别经衍生制备和GC-MS测试分析，所含的脂肪酸种类及其相对含量结果见表3。从所含饱和脂肪酸看，3株真菌油脂的相同点在于均是以棕榈酸、硬脂酸为主，棕榈酸分别为 31.8%、18.0%和16.7%，硬脂酸分别为 19.6%、13.6%和 13.4%；差异在于曲霉NJF3的总饱和脂肪酸和棕榈酸含量明显高于其它2个菌株，且二十四碳酸相对含量也达到3.5%，而枝孢霉NJF4和NJF6的其它短链、长链脂肪酸成分较为微量或者未能检出。

表3 NJF3，NJF4和NJF6的脂肪酸组成Tab.3 Fatty acid composition of NJF3，NJF4 and NJF6

在不饱和脂肪酸方面，曲霉 NJF3、枝孢霉NJF4和NJF6的总不饱和脂肪酸相对含量分别达到 38.4%、66.5%、69.9%，曲霉 NJF3的总不饱和脂肪酸显著低于枝孢霉NJF4和NJF6；3株真菌不饱和脂肪酸均以油酸为主，相对含量分别达到 32.4%、37.2%、40.1%，而 NJF4和 NJF6还含有较高含量的人体必需的亚油酸，相对含量分别达到 27.3%、29.8%。

分析结果表明，枝孢霉NJF4和NJF6的总不饱和脂肪酸、油酸、亚油酸含量较为丰富，总饱和脂肪酸、棕榈酸、硬脂酸含量较低，总体上二者质量较为接近，因此，枝孢霉NJF4和NJF6的油脂在不饱和脂肪酸利用方面可能具有较好的应用潜力。在以往的相关报道中，极地真菌脂肪酸中不饱和脂肪酸含量达到60%以上的报道尚少，尤其是NJF6不饱和脂肪酸含量达69.9%，比已发现的青霉和曲霉生产油脂得到的不饱和脂肪酸含量高很多。而曲霉NJF3总饱和脂肪酸、棕榈酸、硬脂酸含量偏高，总不饱和脂肪酸尤其是亚油酸含量较低，脂肪酸类成分质量上与枝孢霉NJF4和NJF6差距较大，利用价值相对较小。

3 小结

本研究自南极普里兹湾海洋沉积物中分离得到4株真菌菌株，分属于隐球酵母Cryptococcus sp.NJF1、曲 霉 Aspergillus sp.NJF3、枝 孢 霉Cladosporium sp.NJF4和 Cladosporium sp.NJF6。经测定，NJF3、NJF4和NJF6有很好的蛋白磷酸酶活性。同时，测试大田软海绵酸OA对该酶的抑制作用，结果显示：100 nM OA对NJF3和NJF4蛋白磷酸酶有一定抑制作用，而NJF6需要200 nM OA才可以轻微抑制其蛋白磷酸酶活性。分析NJF3、NJF4和NJF6的油脂成分，均以油酸为主，而NJF4和NJF6还含有较高含量的亚油酸，在不饱和脂肪酸利用方面可能具有较好的应用潜力。

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Antarctic fungi：molecular identification，analysis of their protein phosphatase and fatty acid

HUANG Jin-chang1，2，TIAN Xiao-qing1，FAN Cheng-qi1，QIAO Yu-bao1，2，TANG Ying-ying1，2，MA Li-yan1，LU Ya-nan1，YANG Qiao1，HUANG Hong-liang1
（1.Key laboratory of East China Sea＆Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Shanghai 200090，China；2.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Due to the unique characteristics of geography，climate and environment，the microorganisms in polar area and their metabolites show high diversity and novelty.4 fungus strains were isolated from an Antarctic marine sediment sample collected in Prydz Bay by dilution-plate method with 3 selective culture mediums.They were identified as Cryptococcus sp.NJF1，Aspergillus sp.NJF 3，Cladosporium sp.NJF4 and Cladosporium sp.NJF6 with morphological and 18 s rDNA-ITS sequence analysis.Assay of protein phosphatase content and inhibitory effect of okadaic acid（OA）to the protein phosphatase，as well as fatty acid analysis of Aspergillus sp.NJF3，Cladosporium sp.NJF4 and NJF6 were carried out.Good results of protein phosphatase were obtained，and by comparison with theλ-PP standard，the protein phosphatase content reached 0.7322 U· g－1，0.678 U· g－1and 1.2292 U· g－1in NJF3，NJF4 and NJF6，respectively.The protein phosphatase in NJF3 and NJF4 were weakly inhibited by 100 nM OA，while that in NJF6 could only be slightly inhibited by 200 nM OA.Oleic acid was the major fatty acid in these three fungi strains with relative content of 32.4%，37.2%and 40.1%，respectively，and there was also high content of linoleic acid at 27.3%and 29.8%in NJF4 and NJF6.This study laid a foundation for the future investigation on the enzyme and natural metabolites of these fungi strains.

polar microorganisms；Aspergillus sp.；Cladosporium sp.；protein phosphatase；fatty acid

Q 939

A

1004－2490（2017）05－0562－09

2017－04－06

公益性行业（农业）科技专项（No.201203018）；南极周边海域磷虾等生物资源考察与评估专项（No.CHINARE2016－01－06，CHINARE2017－01－06）

黄金昌，男，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。

陆亚男，副研究员。E-mail：luyn＠ecsf.ac.cn