花鳗鲡AQP3基因的分子特征及其应对盐度变化的表达规律

王 丹，李多琳，梁奋飞，曹全全，尹绍武

花鳗鲡AQP3基因的分子特征及其应对盐度变化的表达规律

王 丹，李多琳，梁奋飞，曹全全，尹绍武

（南京师范大学生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，南京 210023）

为了探究花鳗鲡（Anguila marmorata）AQP3基因在不同盐度下的表达规律，利用RACE技术克隆了花鳗鲡AQP3基因cDNA全长序列，并进行了生物信息学分析；通过实时荧光定量PCR（RT－qPCR），检测了花鳗鲡AQP3在9个组织中的分布及盐度胁迫后鳃、肾、肠组织在0、6、12、24 h和3、5、10 d的表达情况。结果显示：花鳗鲡AQP3基因的cDNA全长为1299 bp，开放阅读框 （ORF）为891 bp，5’非编码区 （UTR）和3’非编码区（UTR）分别为60 bp和348 bp，共编码296个氨基酸，具有6段跨膜结构域及2个NPA（天冬氨酸－脯氨酸－丙氨酸）保守结构域。氨基酸多重序列比对结果显示，花鳗鲡AQP3基因与其同属的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）、日本鳗鲡 （Anguilla japonica）同源性分别高达97.0%和96.0%。RT－qPCR检测发现，AQP3基因在鳃组织中表达量最高，而在脾脏中表达量最低；在咸淡水（盐度10）和海水（盐度25）组中，鳃组织的AQP3基因表达水平呈下降趋势，且在各时段均显著下调；肾组织的AQP3表达水平在咸淡水（除24 h外）和海水（除6 h外）组中也显著下调；肠组织的AQP3表达水平在咸淡水组中显著上调，而在海水组中则显著下调。研究表明，花鳗鲡AQP3的mRNA表达量在应对不同盐度环境时呈现不同的表达变化模式，这将为深入揭示花鳗鲡适应盐度变化的分子调控机理奠定理论基础。

花鳗鲡；AQP3；盐度；mRNA表达量

鱼类生活在复杂的水环境中，盐度胁迫会严重威胁着鱼类自身的内稳态，进而影响鱼类的分布、洄游、生长、发育和繁殖等［1］。渗透调节机制是鱼类应对盐度胁迫最直接的反应，在此过程中，鱼类需要调节内部环境与周围水生环境之间的离子、水分子的转运。水通道蛋白被视作细胞中真正的“管道系统”，水分子的高效转运是通过细胞膜上的水通道蛋白实现的［2－5］。AQP3是水通道蛋白家族中一类特殊的水甘油通道蛋白，它不仅能够转运水分子，还能转运甘油这样的小分子溶质［6］。不仅如此，AQP3在抗利尿激素的调节、cAMP及皮质醇的调节、肿瘤发育等方面也发挥着重要作用［7－10］。

花鳗鲡 （Anguila marmorata），隶属于鳗鲡目（Anguilliformes），鳗鲡科（Anguillidae），鳗鲡属，是降海洄游性鱼类，为我国国家II级保护野生动物。花鳗鲡是珍贵的食用鱼类之一，其肉质鲜美，是鳗鲡属鱼类中营养价值最高的品种，优于同属的日本鳗鲡（Anguilla japonica）及欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）［11］。目前，盐度胁迫与鱼类渗透调节机制的相关研究大多集中在细胞（α氯细胞、β氯细胞）、激素（生长激素、胰岛素、皮质醇等）、酶（Na＋／K＋-ATP酶）以及离子通道（钠钾泵、囊性纤维化跨膜传导调节因子）等方面。AQP3作为一类特殊的水甘油通道蛋白，其在鱼类渗透调节中的作用日益受到重视：如 KIM等［12］成功在日本鳗鲡中克隆出了AQP3，研究发现，在淡水和海水中，AQP3在脑、食道、胃、脾、肠、肾、鳃中均表达。DAWOON等［13］探讨了大西洋鳉（Fundulus heteroditus）由淡水转入海水1 d后，AQP3在鳃中的表达水平，结果显示，其AQP3的mRNA表达量显著下降。ENGELUND等［14］对大西洋鲑 （Salmo salar）的研究表明，AQP3在肾组织中集中分布在肾脏近端小管上皮细胞顶端并沿着上皮细胞延伸。对红大马哈鱼（Oncorhynchus nerka）的研究发现，AQP3在鳃中的表达量远远高于AQP8，而AQP8在肠中表达量却远高于AQP3［15］。为了探究花鳗鲡AQP3基因在不同盐度下的表达规律，本研究运用RT-qPCR技术检测了AQP3在花鳗鲡9种不同组织（脑、鳃、肾、肠、肝、心、肌肉、鳔和脾）中的分布，同时检测了花鳗鲡在不同盐度（淡水、咸淡水和海水）、不同时间段 （0、6、12、24 h和3、5、10 d）下，AQP3在3种渗透调节组织（鳃、肾和肠）中的表达变化，以期为进一步解析花鳗鲡渗透调节的分子机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

花鳗鲡幼鳗平均体长 （23.30±2.97）cm，平均体质量 （21.17±2.29）g，取自中国海南文昌金山花鳗鲡科技有限公司。暂养于玻璃循环缸中1月，每日10∶00投喂饲料，摄食30 min后虹吸排污。每日换1／3水体。实验开始前1 d停止进食。实验用水为曝气24 h的自来水，养殖水温保持在25～27°C。试验组中的咸淡水（盐度10）和海水（盐度25）由曝气后的自来水与海水晶按相应比例配制而成。

1.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

根据北京百泰克公司的高纯总RNA快速抽提试剂盒（离心柱型）提取花鳗鲡组织总RNA，用分光光度计检测 RNA浓度、A260／A280值及A260／A230值检测RNA质量，用1% 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。所有样品冻存于－80°C冰箱中备用。以总RNA为模板，根据HiScriptTM1ST strand cDNA Synthesis kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）的说明书进行反转录，获得cDNA第一条链。

1.3 花鳗鲡AQP3基因RACE全长克隆

从花鳗鲡转录组测序的cDNA文库中筛选得到1078 bp的AQP3基因的cDNA中间EST序列，PCR验证 EST序列，并做 5’RACE（美国Invitrogen公司的System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0试剂盒）获得花鳗鲡AQP3基因的5’端序列，3’RACE（美国 Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒）获得AQP3基因的3’端序列。所需引物见表1。

1.4 花鳗鲡AQP3基因的生物信息学分析

利用在线软件 BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）验证花鳗鲡 AQP3基因序列。利用在线软件 ORF finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／orfig.cgi）寻找序列中的开放阅读框。利用软件Clustal X进行序列比对分析。利用DNAman软件进行序列翻译。利用MEGA 5.0软件构建Neighbor-Joining系统发生树。利用在线软件 ExPASy（http：／／web.expasy.org／protparam）分析理化性质。利用在线软件SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de／）预测跨膜区域。利用在线软件SOPMA预测蛋白二级结构。利 用 在 线 软 件 Predictprotein （http：／／www.predictprotein.org／）搜索蛋白结构域及 motif。利用NCBI服务器上的在线分析工具CDART（Conserved Domain Architecture Retrieval Tool）检测氨基酸序列。

表1 花鳗鲡AQP3基因克隆、RACE及荧光定量的引物Tab.1 Primers used for A.marmorata AQP3 cDNA cloning，RACE and qRT-PCR

1.5 花鳗鲡AQP3基因的组织表达分析

从淡水对照组中随机取3 ind花鳗鲡幼鳗，提取9个组织（鳃、肾、肠、肝、脑、脾、鳔、心和肌肉）的总RNA，反转录获得cDNA第一链。根据花鳗鲡及其近缘物种的AQP3序列分别设计特异性引物AQP3-F、AQP3-R，以及作为内参基因的花鳗鲡actin基因特异性上下游引物actin7、actin8（表1）。以获得的9个组织的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，分别检测花鳗鲡AQP3在9个组织中的表达情况。PCR反应体系为20 μL：Faststart Universal SYBR Green Master 10μL，正反引物 （2μmol·μL－1）各 3μL，cDNA模板（5 ng·L－1）4μL。反应程序：95°C预变性 5 min；94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 1 min，35个循环；72°C延伸5 min。于4°C保存。

1.6 不同盐度、不同时段下花鳗鲡AQP3基因的表达分析

为进一步探究不同盐度、不同时段下，花鳗鲡AQP3基因在渗透调节相关组织（鳃、肾、肠）中表达变化规律，将实验所用的幼鳗分为淡水组（对照组）和2个试验组：咸淡水组（盐度10）、海水组（盐度25）。实验前，先将两个试验组的幼鳗置于淡水环境，随后，每天升高3盐度，直至成为咸淡水和海水。分别在0、6、12、24 h和3、5、10 d时，从每组中随机取3 ind幼鳗的鳃、肾、肠组织，实验重复3次（n＝9），用液氮冷却10 min，随后于－80°C保存。提取总RNA，检测AQP3基因的相对表达量。

1.7 数据处理

采用 2-△△CT法进行数据处理［16］，△CT ＝Ct target（花鳗鲡 AQP3基因）－Ct actin（花鳗鲡actin基因）；△△CT＝△CT试验组－△CT对照组（0小时）。利用统计学软件SPSS 23对计算得到的数据进行单因子方差分析 （one-way ANOVA）。若 P＜0.05，则显著差异；P＜0.01，则极显著差异。所有数据采用均值±标准差（Means±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 花鳗鲡AQP3基因的序列分析

通过RACE技术克隆得到AQP3基因的cDNA全长序列1 299 bp，其中ORF为891 bp，5’端UTR为60 bp，3’端UTR为348 bp，共编码296个氨基酸（图1）。

ExPASy软件预测，AQP3基因的相对分子质量 （molecular weight）为32.22 kDa，理论等电点（theoretical isoelectric point）为6.89，总的平均亲水系 数 （grand average of hydropathicity，GRAVY）为0.546。SMART软件对AQP3氨基酸序列分析发现了6段跨膜结构域（图2），跨膜位点：26－48、58－80、101－123、157－179、192－214和 247－269。CDART（conserved domain architecture retrieval tool）对花鳗鲡AQP3基因的氨基酸序列检测，发现两个NPA（天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）保守结构域。经Predictprotein软件预测，花鳗鲡AQP3基因含有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个焦激肽位点、8个N-酰基化位点、1个MIP超家族特征位点、4个N糖基化位点、3个O糖基化位点且序列中的5个半胱氨酸未形成二硫键。利用SOPMA软件对花鳗鲡AQP3蛋白二级结构分析，发现二级结构中α螺旋、β转角、延伸链及无规则卷曲分别占序列全长的45.27%、7.43%、22.64%和 24.66%。

2.2 花鳗鲡AQP3基因的氨基酸序列同源性及系统进化分析

利用Clustalx 2软件，将花鳗鲡AQP3氨基酸序列与欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、大西洋鲑等进行对比分析和同源性检测。结果显示，花鳗鲡AQP3氨基酸序列与9种已知物种的AQP3氨基酸序列同源性很高，为69% ～97%（图3）。其中，与同属的欧洲鳗鲡、日本鳗鲡同源性最高，分别为97%、96%。

图2 花鳗鲡AQP3蛋白质跨膜区域Fig.2 Transmembrane graphics of AQP3 protein of A.marmorata

基于AQP3氨基酸序列，利用MEGA 5.0软件构建Neighbor-Joining系统发生树（图4）。结果显示，所有鱼类聚集为一支，所有两栖和哺乳类动物聚集为另一支。在鱼类分支中，花鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡聚集成一支，这与三者之间极高的同源性是一致的。

2.3 花鳗鲡AQP3基因在淡水中的组织表达分布

RT-qPCR结果显示（图5），花鳗鲡AQP3基因在9个组织中均有表达。其中，花鳗鲡AQP3基因在鳃组织中表达量最低，而在脾脏中表达量最高。

图3 脊椎动物AQP3氨基酸序列多重比对Fig.3 Multiple sequences alignment of AQP3 amino acid in vertevrates

图4 脊椎动物AQP3 NJ发生树Fig.4 Neighbor joining phylogenetic tree based on AQP3 amiono acid sequences of vertebrates

图5 淡水对照组中花鳗鲡AQP3在不同组织中的相对表达量Fig.5 Relative expression of A.marmorata AQP3 in different tissues in fresh water

2.4 不同盐度、不同时段下花鳗鲡AQP3基因的表达分布

在咸淡水（盐度10）、海水（盐度25）组中，花鳗鲡鳃组织的AQP3的mRNA在各时段中均显著下调。其中，咸淡水组在6 h时表达量最低，仅为淡水对照组的21.0%，在12 h及随后时段中，AQP3的表达量相对稳定，但仍明显低于淡水组；海水组在3、5、10 d时表达量相对较低，仅为淡水对照组的6% ～7%。（图6）。

图6 盐度10和盐度25下花鳗鲡鳃组织中AQP3 mRNA的表达Fig.6 Temporal expression profiles of A.marmorata AQP3 mRNA in gill under 10 ppt and 25 ppt by using RT-qPCR

在肾组织中，咸淡水组中AQP3的表达量在各时段均显著下调（除24 h外）。其中，在12 h时咸淡水组中的表达量降至最低，在24 h时表达量上调至淡水对照水平，在3、5、10 d时表达量再次显著降低。海水组中AQP3的表达量在各时段也显著下调（除6 h外）。在6 h时海水组表达量上调至淡水组的2.5倍，随后表达量显著降低，在12 h时表达量降至最低，仅为淡水组的14%，在12 h及随后时段表达量持续较低（图7）。

图7 盐度10和盐度25下花鳗鲡肾组织中AQP3 mRNA的表达趋势Fig.7 Temporal expression profiles of A.marmorata AQP3 mRNA in kidney under 10 ppt and 25 ppt by using RT-qPCR

在肠组织中，咸淡水、海水组的表达量均先在6 h时上调，随后咸淡水组中AQP3表达量显著上调，而海水组中AQP3表达量显著下调。咸淡水组中AQP3表达量在6 h时显著上调，在12 h下调至淡水对照水平，随后在24 h和3、5 d表达量再次上调，且在3 d时表达量达到最大值为淡水组的2.5倍，在10 d时表达量再次下调至淡水对照水平。海水组的AQP3表达量在6 h时上调，在12 h时表达量下调，在12 h及随后时段表达量均处于较低水平，且在5 d时表达量最低。（图 8）。

3 讨论

花鳗鲡AQP3基因的全长克隆及氨基酸序列分析表明，6段跨膜结构域及2个NPA（天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）保守结构域是水通道蛋白家族典型的序列特征［17－19］，其在 141～143位点丢失的N糖基化位点与鳗鲡属其它鱼类的研究结果一致［20］，这进一步证明了AQP3在结构和功能上的保守性。脊椎动物氨基酸序列多重比对结果与构建的NJ系统发生树结果是一致的，比对发现花鳗鲡AQP3与同属的欧洲鳗鲡、日本鳗鲡的同源性分别高达97%和96%，在系统发生树中三者也在鱼类分支上聚集一支，这不仅证明了AQP3在鳗鲡属中的高度同源性，还为揭示花鳗鲡在系统进化中的地位提供了可靠依据。

花鳗鲡AQP3基因在鳃中表达量最高，其次为肌肉和肠，而在肾中的表达量却较低。无论是在淡水环境还是咸水环境，鳃、肾、肠组织都是鱼类应对盐度胁迫、维持渗透平衡的重要组织［21］。在本研究中，AQP3在鳃、肠组织中表达量较高，这与KIM等［12］对日本鳗鲡的研究是一致的。同时，鱼类的鳃相当于哺乳动物的呼吸道，MATSUZAKI等［22］对哺乳动物的AQP3表达分布研究表明，在哺乳动物中，AQP3广泛分布于一些与外界环境接触的组织中，如眼、呼吸道、消化道、尿道、皮肤等组织。花鳗鲡AQP3在肌肉中具有较高的表达量可能与肌肉的储水功能有关。肾作为花鳗鲡的重要渗透调节组织之一，其表达量却相对较低，推测可能与鱼类肾脏排泄低渗尿的性质有关［23］。

AQP3位于鳃组织的氯细胞基底膜侧，与Na＋、K＋-ATP酶共处［24－25］。本研究表明，在鳃组织中，花鳗鲡AQP3基因在咸淡水（盐度10）和海水（盐度25）组中的表达量均显著下调。此结果与DAWOON等［13］对大西洋鳉的研究是一致的，将大西洋鳉由淡水转入海水1 d后，AQP3在鳃中的表达水平显著降低。MACIVER等［26］对欧洲鳗鲡的研究、CUTLER等［27］对日本鳗鲡的研究结果同样表明，在盐度胁迫下，鳃组织中AQP3的mRNA表达量显著降低。由此表明，在鳃组织中，盐度胁迫广泛影响鳃组织中AQP3的表达。在渗透调节过程中，花鳗鲡鳃组织的AQP3扮演着重要作用。

在肾脏中，咸淡水（除24 h外）、海水组（除了6 h外）的AQP3的表达水平均显著下调。甘远迪等［28］利用RT-qPCR检测了AQP3在萨罗罗非鱼 （Sarotherodon melanothern）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肾脏中的表达，研究发现海水组表达水平明显低于淡水组。本研究结果与甘远迪等［28］对萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼的研究结果是一致的。但是，TIPSMARK等［29］对大西洋鲑的研究却发现，将大西洋鲑由淡水转移到海水24 h后，其肾脏中AQP3的表达量却上涨10倍，并且在随后两周也维持在较高水平。推测在盐度胁迫下，不同物种肾脏中AQP3的表达模式具有差异。DANZLER等［30］研究表明，大西洋鲑肾组织中AQP3表达量的升高可能与肾脏的保水功能有关。在此过程中，花鳗鲡AQP3表达量下调的原因有待进一步研究。

本研究表明，在咸淡水组中，花鳗鲡肠组织的AQP3表达水平明显高于淡水组；而海水组中表达水平则明显降低。本研究结果与CHOIET等［31］对红大马哈鱼的研究结果是一致的。CHOIET等［31］研究表明，在低盐度海水组中，幼鲑（parr stage salmon）AQP3的表达水平显著上升，在高盐度海水组中，幼鲑及二龄幼鲑 （smolt stage salmon）AQP3的表达水平均显著下降。当鳗鲡属鱼类肠液渗透压低于血液渗透压时，便会通过肠道吸水，弥补内外环境渗透压差引起的失水［32－34］。笔者推测，咸淡水组中 AQP3表达量上调可能与此有关。不同于咸淡水组，海水组中AQP3表达水平显著下降。由此表明，盐度不同，花鳗鲡肠组织中AQP3功能可能有所差异。但是，KIM等［12］对日本鳗鲡的研究结果却与之不同。KIM等［12］研究结果显示，AQP3在海水组直肠中的表达水平远高于淡水组。由此表明，AQP3在不同物种的肠组织中具有不同的表达模式。在6 h时，咸淡水、海水组中AQP3表达水平均显著上调，表明在咸淡水、海水组中，AQP3在早期可能都参与了吸水。

AQP3是位于细胞膜上的重要水通道蛋白之一［12，34－36］。本研究发现，在不同盐度、不同时段下，花鳗鲡鳃、肾、肠组织的AQP3呈现不同的表达变化模式，并且在各时段中，AQP3基因的表达水平均呈显著差异。可见，AQP3在花鳗鲡渗透调节过程中扮演了重要角色。

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Cloning and effects of different salinities on aquaporin 3（AQP3）in juvenile marbled eel，Anguilla marmorata

WANG Dan，LI Duo-lin，LIANG Fen-fei，CAO Quan-quan，YIN Shao-wu
（Jiangsu Province Key Laboratory for Biodiversity and Biotechnology，College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023）

In order to successfully adapt to threats of salinities，fish possesses AQPs（aquaporin）which are essential for water transport in the process of osmoregulation and maintaining homeostasis.AQP3 is unique in that it can not only transport water，but also participate in glycerin，urea and other small nitrogen-containing molecule transport activities.The method of RACE was applied to clone the DNA sequence of AQP3 from Anguila marmorata and then bioinformatics analysis was carried on for the purpose of investigating the role of AQP3 in A.marmorata osmotic adjustment process.The technique of real-time qRCR was adopted to detect mRNA expression in the blank tissues（including brain，gill，intestine，kidney，liver，muscle，heart，spleen and swim bladder）of fish acclimated to fresh water（0 ppt）.The same batch of A.marmorata was acclimated to two other salinity gradients：brackish water（10 ppt）and sea water（25 ppt），to observe expression changing patterns at different time（0 h，6 h，12 h，24 h，3 d，5 d and 10 d）in three osmoregulation associated tissues（including gill，kidney and intestine）.The results showed that the full length of A.marmorata AQP3 cDNA was 1 299 bp，containing an 891 bp open reading frame，with a 60 bp 5’untranslated region（UTR）and 348 bp 3’UTR.It encoded 296 amino acids，owning a six transmembrane structure and two NPA（aspartic acid-proline-alanine）conserved domains.The multiple amino acid sequence comparison showed that AQP3 of A.marmorata shared the highest identity with European eel（Anguila anguila，97%）and Japanese eel（Anguila japonica，96%）.The higher expression was detected in gill，with the highest expression，intestine and muscle，yet an extremely low expression was observed in spleen，with the lowest expression，kidney，liver and other tissues.AQP3 mRNA expression level in the gill decreased significantly at all time of the experiment when exposed to brackish water（10 ppt）and sea water（25 ppt）.In the kidney，the mRNA expression significantly decreased except for 24 h in brackish water and 6 h in sea water.In the intestine，the mRNA expression was upregulated in the brackish water group，while the expression in the sea water group was downregulated.The experimental results suggested that AQP3 of A.marmorata may involve in the osmoregulation activity and present different expression changing patterns under different salinity gradients.These findings might contribute a lot to reveal the molecular mechanism of A.marmorata under different salinity gradients.

Anguila marmorata；AQP3；salinity；mRNA expression

S 917.4

A

1004－2490（2017）05－0518－11

2016－12－21

江苏省自然科学基金项目（BK20141450）

王 丹（1993－），女，江苏人，硕士研究生，主要从事鱼类生理与遗传育种研究。E-mail：wangdan1612＠163.com

尹绍武，教授，博士生导师。Tel：025－85891840，E-mail：yinshaowu＠163.com