汉滩病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞模型的建立

张尧，冯伟，张晓晓，应旗康，刘梓谕，吴兴安，王芳

1.第四军医大学 学员旅，陕西 西安 710032；2.第四军医大学 微生物学教研室，陕西 西安 710032

汉滩病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞模型的建立

张尧1，冯伟1，张晓晓2，应旗康2，刘梓谕2，吴兴安2，王芳2

1.第四军医大学 学员旅，陕西 西安 710032；2.第四军医大学 微生物学教研室，陕西 西安 710032

目的：建立汉滩病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞模型。方法：PBS灌洗6～8周龄C57BL/6小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞后，以100 TCID50汉滩病毒76-118株感染小鼠腹腔巨噬细胞，通过间接免疫荧光、ELISA和Realtime PCR检测病毒感染情况。结果：病毒感染3d后，间接免疫荧光和ELISA检测到病毒核衣壳蛋白的表达，Realtime PCR检测到病毒核酸的表达。结论：建立了汉滩病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞的模型，为进一步阐明汉滩病毒的发病机制奠定了基础。

汉滩病毒；小鼠腹腔巨噬细胞；感染

汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，由其引起的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是一类以发热、出血和肾功能损伤为特征的急性传染病[1]，全球每年发病人数达10万例,其中90％的病例发生于中国,病死率高达0.3％～10％[2]。

汉滩病毒不仅可以直接引起全身小血管和毛细血管损伤、血管通透性增加和微循环障碍，还可引起免疫应答异常，进而引发高热、出血及肾损害等临床症状[3]。我国是HFRS疫情最为严重的国家，流行区域广，发病人数居全球之首，且病死率较高[4]，主要型别为汉滩病毒和汉城病毒（Seoul virus，SEOV）。针对汉滩病毒目前尚无特异有效的治疗药物。

巨噬细胞是机体发挥抗病毒作用的重要免疫细胞，可通过分泌多种细胞因子而参与免疫调节[5]。探讨汉滩病毒和巨噬细胞之间的关系，有助于了解病毒在体内扩散过程及巨噬细胞在发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级6～8周龄C57BL/6雌性小鼠，体重18～20g，由第四军医大学动物实验中心饲养；汉滩病毒76-118株由本室保存；SYBR实时定量PCR试剂盒、PrimeScript RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；Cy3标记的羊抗鼠IgG购自康为世纪公司；抗汉滩病毒单克隆抗体1A8及HRP-1A8由本室制备并保存，可识别汉滩病毒核衣壳蛋白（nucleo⁃protein，NP）上特异性抗原位点，具有较高的特异性结合活性。

1.2 小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养

采用椎骨脱臼法处死小鼠，立即放在超净工作台上，用75％乙醇消毒皮肤，剪开腹部皮肤暴露腹腔，用无菌注射器吸取磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗腹腔，吸取腹腔灌洗液，制成腹腔巨噬细胞悬液，以PBS液洗细胞2次，离心（1500r/min，10min），用完全DMEM培养基调整细胞浓度至1×106/mL铺至24孔板的细胞玻片上，37℃、5％CO2培养箱中静置2h，弃去上层悬浮细胞，PBS洗涤2次后加入完全DMEM培养基，24h后进行病毒感染。

1.3 间接免疫荧光（IFA）检测NP在感染细胞中的表达

用100 TCID50的汉滩病毒于37℃、CO2孵箱感染腹腔巨噬细胞2h后，添加含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、CO2孵箱中培养72h，按常规方法进行IFA实验，一抗为抗汉滩病毒NP抗体1A8（1∶1000稀释），二抗为Cy3标记的羊抗鼠IgG（1∶2000稀释），荧光显微镜观察、照相。

1.4 病毒感染细胞中病毒核酸的检测

设计编码HTNV NP的S基因及小鼠GAPDH引物，由北京奥科生物公司合成。引物分别为HTNV S Forward（5′-GATCAGTCACAGTCTAGTC A-3′）、HTNV S Reverse（5′-TGATTCTTCCACCA TTTTGT-3′）、Mouse GAPDH Forward（5′-AGGCC GGTGCTGAGTATGTC-3′）和 Mouse GAPDH Re⁃verse（5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′）。

用TRIzol法提取感染细胞的RNA，以其为模板用RT-PCR试剂盒进行逆转录获得cDNA，分别以 HTNV S Forward/Reverse及 Mouse GAPDH For⁃ward/Reverse为引物，用实时定量PCR试剂盒检测样本中的HTNV特异性核酸。

1.5 感染细胞中病毒抗原的检测

收取病毒感染的巨噬细胞，于-80℃冰箱中快速冷冻20min，反复冻融3次后，4℃、12 000r/min离心30min，收集上清，采用夹心ELISA法检测上清中的HTNV抗原。具体方法如下：取1∶2000稀释的抗NP单克隆抗体于4℃包被过夜，用洗涤缓冲液洗涤3次后，将细胞裂解液上清按1∶10稀释，每孔加入100μL，设置负孔和阴性对照，37℃孵育1h，洗涤3次后加入1∶2000稀释的HRP-1A8抗体，37℃孵育1h，洗涤3次后加入TMB显色，室温静置15min后加入2 mol/L H2SO4终止反应，测定各孔的D450nm值。

2 结果

2.1 间接免疫荧光检测汉滩病毒NP在汉滩病毒感染后的腹腔巨噬细胞中的表达

经间接免疫荧光检测，发现汉滩病毒感染后，小鼠腹腔巨噬细胞能表达汉滩病毒核衣壳蛋白（图1）。

2.2 汉滩病毒感染腹腔巨噬细胞中病毒抗原的检测结果

汉滩病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞后，以夹心ELISA法检测病毒感染细胞中HTNV特异性抗原，结果显示病毒感染巨噬细胞的D450nm值与病毒感染Vero-E6细胞的D450nm值相当，表明病毒感染后的巨噬细胞中有病毒抗原的表达（图2）。

2.3 汉滩病毒感染腹腔巨噬细胞中病毒核酸的检测结果

汉滩病毒感染腹腔巨噬细胞后，以qRT-PCR法检测感染细胞中的病毒核酸，结果显示感染组细胞中的病毒核酸拷贝数明显高于对照组，表明病毒感染后巨噬细胞中有病毒核酸复制（图3）。

图1 汉滩病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞中病毒抗原的间接免疫荧光结果

图2 汉滩病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞中病毒特异性抗原的ELISA检测结果

图3 汉滩病毒感染C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞中病毒核酸的qRT-PCR结果

3 讨论

机体主要通过复杂的免疫系统抵御外来病原体，包括2种主要方式：非特异性和特异性的。病毒感染后，非特异性免疫提供首道防线且影响随后的特异性免疫。巨噬细胞是机体免疫系统中具有多种功能的免疫细胞，参与机体非特异性免疫反应，具有很强的吞噬功能。巨噬细胞在产生特异性细胞免疫和体液免疫之前发挥了重要的防御作用，同时能分泌多种细胞因子和趋化因子。细胞因子一方面可作为宿主介导控制病毒复制的重要组分，另一方面也可作为病毒破坏宿主免疫系统的重要因素。汉滩病毒的致病机理是病毒感染诱导宿主免疫病理[6]。因此，有必要进一步研究汉滩病毒感染与巨噬细胞、细胞因子之间的关系，这对深入阐明汉滩病毒的致病机理尤为重要。

本实验主要以体外方式感染单核-巨噬细胞，检测HTNV感染小鼠腹腔巨噬细胞的情况，通过间接免疫、ELISA和qRT-PCR法检测，结果显示HTNV能感染小鼠腹腔巨噬细胞并在其中增殖，为下一步研究巨噬细胞在汉滩病毒感染过程中的作用奠定了基础。

[1] Lee H W,Lee P W,Johnson K M.Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever[J].J In⁃fect Dis,1978,137:298-308.

[2] Krautkramer E,Zeier M,Plyusnin A.Hantavirus infec⁃tion:an emerging infectious disease causing acute re⁃nal failure[J].Kidney Int,2013,83:23-27.

[3] Hepojoki J,Vaheri A,Strandin T.The fundamental role of endothelial cells in Hantavirus pathogenesis[J].Front Microbiol,2014,5:727.

[4] Ruo S L,Li Y L,Tong Z,et al.Retrospective and prospective studiesofhemorrhagic feverwith renal syndrome in rural China[J].J Infect Dis,1994,170:527-534.

[5] DiNapoli S R,Hirsch V M,Brenchley J M.Macro⁃phages in progressive human immunodeficiency virus/simian immunodeficiency virus infections[J].J Virol,2016,90（17）:7596-7606.

[6] Mackow E R,Gavrilovskaya I N.Hantavirus regula⁃tion of endothelial cell functions[J].Thromb Haemost,2009,102:1030-1041.

Establishment of Hantaan Virus Infected Mouse Peritoneal Elicit Macrophage

ZHANG Yao1,FENG Wei1,ZHANG Xiao-Xiao2,YING Qi-Kang2,LIU Zi-Yu2,WU Xing-An2,WANG Fang2*
1.Cadet,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;China
*Corresponding author,E-mail:wangf07@fmmu.edu.cn

Objective:To establish a macrophage model for Hantaan virus（HTNV） infection by using the cul⁃ture of mouse peritoneal elicit macrophage.Methods:Inject 5mL of ice cold PBS（with 3％FCS） into the perito⁃neal cavity.After injection,gently massage the peritoneum to dislodge any attached cells into the PBS solution and then collect as much as possible,and deposit the collected cell suspension in tubes on ice.The mouse perito⁃neal macrophages were cultured and infected with 100 TCID50HTNV 76-118 strain.Indirect immunofluorescent as⁃say（IFA）,ELISA and real-time PCR were used to detect the protein or nucleic acid of Hantaan virus.Results:3 days after infection,the nucleoprotein was detected out by IFA and ELISA,the nucleic acid of nucleoprotein was confirmed by real-time PCR.Conclusion:Direct infection of HTNV on the cultured mouse peritoneal macro⁃phages were identified,to explore the pathogenic mechanism for HTNV infection.

Hantaan virus;mouse peritoneal elicit macrophage;infection

R373;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0503-03

2017-01-06

国家自然科学基金（31470890，31270978）；军队重点课题（BWS13G）；陕西省科技统筹创新工程计划（2013KTCL03-06）

张尧（1994- ），男，本科在读，（E-mail）516091724@qq.com

王芳，（E-mail）wangf07@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.019