结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

白娜，毛莹莹，颜仁和，林明，陈兴露，李青青，陈惠莹，刘军，李红卫

1.南方医科大学 检验与生物技术学院生物治疗研究所，广东 广州 510515；2.云南省玉溪市人民医院 核医学科，云南 玉溪 653100；3.广州伯尼兹生物科技有限公司，广东 广州 510663

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

白娜1，2，毛莹莹1，颜仁和3，林明2，陈兴露1，李青青1，陈惠莹1，刘军1，李红卫1

1.南方医科大学 检验与生物技术学院生物治疗研究所，广东 广州 510515；2.云南省玉溪市人民医院 核医学科，云南 玉溪 653100；3.广州伯尼兹生物科技有限公司，广东 广州 510663

目的：构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞，高效表达分泌性38kD蛋白。方法：设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体，然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0，经酶切鉴定正确后，PEI转染法导入293T细胞，换不含血清的DMEM培养基培养3d后收集细胞及上清，采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果：酶切结果显示，获得正确的含38kD基因的重组表达载体；Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论：构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD，该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白，为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。

结核分枝杆菌38kD蛋白；真核表达载体；分泌表达；HEK293T细胞

近年来由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病在全球范围内死灰复燃，呈回升趋势[1-2]。我国结核病疫情目前依然很严重，是世界上结核病高负担第二大国，仅次于印度[3-4]。结核杆菌的检测方法主要有细菌学、免疫学及分子生物学方法等，前者是结核病控制、流行病学调查和临床医生用于诊断及鉴别诊断结核的金标准，但因其耗时长，阳性率低而受限；分子生物学技术虽然检查快速、灵敏，但也存在对技术及人员素质要求高、操作复杂等问题；免疫学诊断方法操作简便、快速，便于推广，且有良好的特异性和敏感性，具有血清学诊断价值，成为结核病诊断的良好辅助方法[5-7]。研究表明，38kD抗原上具有结核复合体特异的T淋巴细胞抗原决定簇，可以诱导强烈的抗体和T淋巴细胞反应，部分对抗结核分枝杆菌感染作用[8]。在本研究中，我们利用基因工程技术构建了含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的表达载体，并以PEI转染法导入HEK293T细胞，高效分泌表达38kD蛋白，为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞系HEK293T、表达载体pcDNA3.0为本实验室保存；大肠杆菌DH5α、报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）购自天根生化科技（北京）有限公司；pcDNA3.0-EGFP由本实验室构建；限制性内切酶NheⅠ、MluⅠ、EcoRⅤ和DL2000 DNA marker购自 TaKaRa公司；Blunting酶、1mmol/L dNTP购自New England Biolabs公司；限制性内切酶ApaⅠ购自Thermo scientific公司；T4DNA连接酶购自Roche公司；蛋白marker、质粒快速小提试剂盒购自GeneStar公司；琼脂糖凝胶片段回收试剂盒购自Magen生物公司；DNA清洁回收试剂盒购自Axygen公司；脱脂奶粉、PVDF膜购自Bio-Rad公司；抗6×His单克隆抗体购自天根公司；羊抗小鼠IgG-HRP购自Solarbio公司；细胞基础培养基DMEM、胎牛血清（FBS）、胰酶、磷酸盐缓冲液（PBS）粉末购自Hyclone公司。

1.2 重组表达载体pcDNA3.0-38kD的构建及鉴定

根据结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv（GenBank Accession：AL123456.3）的基因组序列，设计合成编码38kD嵌合蛋白的cDNA片段，序列经过优化（http://www.jcat.de）以适于在哺乳动物细胞中表达（图1）。

合成的cDNA片段被克隆到T载体获得重组质粒pMD19T-38kD[通用生物系统（安徽）有限公司]，用NheⅠ、MluⅠ双酶切获得38kD基因片段约1152bp，进行补平、清洁处理；真核表达载体pcDNA3.0用EcoRⅤ单酶切后去磷酸化处理。将pcDNA3.0酶切回收产物与38kD基因片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑过夜培养的LB平板上的单克隆接种到5mL含100μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，提取质粒，得到重组载体质粒pcDNA3.0-38kD。用ApaⅠ酶切pcDNA3.0和重组质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

图1 结核分枝杆菌38kD嵌合蛋白cDNA编码核苷酸序列

1.3 重组载体质粒转染HEK293T细胞

用含10％FBS的DMEM培养基常规培养HEK293T细胞，转染前1d胰酶消化、传代细胞，铺于6孔板中，细胞汇合度约80％时即可用PEI法将pcDNA3.0-EGFP及pcDNA3.0-38kD重组载体质粒进行转染[9-10]。转染24h后将培养基换成无血清的DMEM培养基，转染48h后观察细胞荧光，判断转染效率。

1.4 Western印迹检测38kD蛋白的表达

换液后第3d收集细胞上清，4℃、13 000r/min离心5min；每孔细胞用PBS洗涤2次后加入含1％PMSF的RIPA裂解液200μL，冰上裂解30min，收集细胞黏液于灭菌EP管中，加入50μL 5×还原上样缓冲液，金属浴煮沸10min裂解细胞，4℃、13 000r/min离心 5min，取上清进行SDS-PAGE，用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，用10％脱脂奶粉液室温摇床温和振荡3h封闭，用1∶5000稀释的His一抗于4℃孵育过夜；用1×TBST洗膜4次，每次 7min；用 1∶10 000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗室温摇床温和振荡孵育 50min，用 1×TBST洗膜4次，每次7min；每张膜加500μL发光液，暗室中用感光胶片显色。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌38kD蛋白基因重组真核表达载体的鉴定

pcDNA3.0和pcDNA3.0-38kD的ApaⅠ酶切鉴定结果见图2。重组质粒pcDNA3.0-38kD第2、10、12号酶切后获的的小片段条带位置与预期大小相符（正向连接小片段为984bp），表明38kD重组表达质粒pcDNA3.0-38kD构建成功。

2.2 重组质粒转染HEK293T细胞

分别用pcDNA3.0-EGFP和pcDNA3.0-38kD重组载体转染HEK293T细胞，48h时在荧光显微镜下观察，判断转染效率。pcDNA3.0-EGFP转染的细胞有较强的荧光，pcDNA3.0-38kD转染后细胞无荧光，与预期结果相符，说明转染成功（图3）。

2.3 Western印迹检测38kD蛋白在细胞中的表达

重组质粒转染HEK293T细胞24h后，换为不含血清的DMEM培养基，换液后第3d收取细胞及上清蛋白，样品处理后，用Western印迹在细胞及上清中均可检测到38kD蛋白的表达，而转染pcDNA3.0-EGFP的对照组没有相应条带（图4）。

图2 重组质粒pcDNA3.0-38kD的单酶切鉴定

图3 重组质粒转染HEK293T细胞48h的荧光情况

图4 Western印迹鉴定细胞及上清中38kD蛋白的表达

3 讨论

结核病的快速准确诊断是全球控制结核病的重要措施。1998年，Cole等分离和鉴定出一些极具辅助诊断潜力的特异性蛋白质抗原[11]，为结核病特异性诊断奠定了基础。结核杆菌分泌蛋白38kD的免疫学活性最强，其用于单项诊断结核病的效果优于其他单一抗原[12-14]。38kD蛋白又名蛋白抗原b（Pab），是一种磷酸盐转运蛋白，是结核杆菌分泌较多的抗原，日益成为研究热点[15]。38kD蛋白属于分泌蛋白，结核病患者体内抗38kD蛋白的抗体水平较高，是结核杆菌最主要的免疫原[16]，目前被证明是最有效的单个血清学诊断抗原。有关学者对CFP10-ESAT6、38kD、Ag85B和HspX等4种结核相关抗原的研究显示，单一抗原中38kD的诊断性能最佳，特异度和灵敏度均较高[16]。38kD蛋白广泛用于结核病的血清学诊断试验，检测的敏感性和特异性均较高[17]。

哺乳动物细胞能够正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别并去除基因中的内含子，再经过剪切加工成为成熟的mRNA，并准确地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等翻译后加工过程，产生具有生物学活性，最接近天然蛋白的重组产物[18]。对比于胞质内表达，分泌表达有众多优势：简化蛋白产物的检测与纯化，降低生物处理工艺的复杂性，减少细胞相关蛋白的降解，提高蛋白产物的产量与质量等[19]。

为了使重组结核分枝杆菌38kD蛋白在哺乳动物细胞中高水平、分泌性表达，我们设计合成了含小鼠Igk信号肽38kD嵌合蛋白的cDNA片段，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.0中，通过PEI方法导入哺乳动物细胞HEK293T，在转染细胞及其培养上清中都能检测到38kD蛋白，说明构建了含结核分枝杆菌38kD蛋白的重组真核表达载体，且能在哺乳动物细胞293T中高效表达并分泌到细胞外。另外，由于嵌合蛋白C端含有6×His标签而可使用镍柱进行纯化。总之，我们构建了结核分枝杆菌38kD蛋白重组真核表达质粒，可将其用于转染293T细胞大量生产纯化38kD蛋白，从而为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。

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Construction of Eukaryotic Expression Vector of Mycobacte⁃rium tuberculosis38kD Protein and its Secretory Expres⁃sion in HEK293T Cells

BAI Na1,2,MAO Ying-Ying1,YAN Ren-He3,LIN Ming2,CHEN Xing-Lu1,LI Qing-Qing1,CHEN Hui-Ying1,LIU Jun1,LI Hong-Wei1*
1.School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515;2.Department of Nuclear Medicine,Yuxi People's Hospital of Yunnan Province,Yuxi 653100;3.Guangzhou Bioneeds Biotechnology Co.,Ltd,Guangzhou 510663;China.

Objective:To construct a robust expressing vector of Mycobacterium tuberculosis 38kD protein,which is able to induce high efficient and secretory expression of 38kD protein in transfected HEK293T cells.Methods:The 38kD gene of M.tuberculosis was synthesized and cloned to T-vector,and then subcoloned into the pcDNA3.0 vector.The recombinant pcDNA3.0-38kD was verified by enzyme digestion,and then transfected into HEK293T cells by polyethylenemine（PEI）-based transfection.The transfected cells and supernatants were collected separately for the detection of 38kD protein by Western blot after the media were changed to serum-free DMEM media for 3 days.Results:We have obtained a robust M.tuberculosis 38kD protein expressing vector,pcDNA3.0-38kD,which can elicit the expression of high level of 38kD protein in both cell supernatants and lysates in transfectedHEK293T cells.Conclusion:High level of secretory M.tuberculosis 38kD protein was expressed in mammalian cells,and it can be potentially used in the development of serological diagnostic kit for tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis 38kD protein;eukaryotic expression system;secretory expression;HEK293T cells

Q78

A

1009-0002（2017）04-0451-04

2017-02-27

白娜（1984- ），女，检验技师，硕士研究生，（E-mail）bn_281525013@163.com；毛莹莹（1988- ），女，博士，（E-mail）maoyy2011@163.com；二者为并列第一作者

李红卫，（E-mail）hongweil@yahoo.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.009