UPLC-MS/MS法测定凉茶饮料中的有机酸和黄酮类化合物

韩婉清，王斌，王莉，冼燕萍

（广州质量监督检测研究院，国家加工食品质量监督检验中心（广州），广州市食品安全检测技术重点实验室，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广东广州510000）

UPLC-MS/MS法测定凉茶饮料中的有机酸和黄酮类化合物

韩婉清，王斌，王莉，冼燕萍*

（广州质量监督检测研究院，国家加工食品质量监督检验中心（广州），广州市食品安全检测技术重点实验室，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广东广州510000）

建立一种超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时测定凉茶饮料中5种有机酸和黄酮类化合物的方法。样品经高速离心，甲醇稀释后，经 BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，乙腈-0.1%甲酸水（体积分数）梯度洗脱，串联质谱电喷雾负离子扫描，多反应监测（MRM）模式检测。5种目标物的方法检出限在0.2 mg/L～0.5 mg/L，在0.02 mg/L～0.5 mg/L浓度范围内，线性相关系数均大于0.999 0。添加水平为1.0 mg/L～40 mg/L时，平均回收率为86.3%～102%；相对标准偏差（RSD，n=6）为2.4%～8.7%。

凉茶；有机酸；黄酮类化合物；超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）

凉茶是由药食同源的植物为原料，经熬制后具有清热解毒、生津止渴等功效的植物饮料。由于凉茶是采用化学成分尚不明确的植物原料熬制而成的复方制剂，产品成分复杂，目前尚未有关于凉茶具体组分的明确报道，仅有国内部分机构利用质谱技术进行主要活性成分的定性筛查。游飞祥等利用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（high performance liquid chromatography of quadrupole time of flight-mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）分析鉴定了植物凉茶中的化学成分，共鉴定出43种有机酸类和黄酮苷类物质[1]。梁慧等利用HPLC-TOF-MS和高效液相色谱-离子阱质谱（high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometric，HPLC-IT-MS）进行癍痧凉茶的化学成分分析，鉴定出主要活性成分为有机酸、黄酮类和三萜皂苷类物质[2]。但是，对凉茶饮料中这些活性成分的定量测定鲜有文献报道。

目前，国内外对于有机酸、黄酮类化合物的检测方法研究，主要集中在果汁[3]、酒[4]、植物性食品[5]、中草药[6]等领域，所用方法多为液相色谱法[7-8]、离子交换色谱法[9]，亦有关于毛细管电泳[10]、气相色谱[11]等方法的报道。这些检测方法都存在因易受基质干扰而造成假阳性的缺陷，因此对样品的净化要求高。本文采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时测定凉茶饮料中奎宁酸、绿原酸、甘草苷、柚皮苷、槲皮素等5种有机酸和黄酮类物质，5种目标物的化学结构式见图1。

图1 5种目标物的化学结构式Fig.1 Structures of 5 target compounds

由于凉茶饮料成分复杂，植物源性激素、多糖、色素等物质的存在都可能对目标物的痕量检测造成干扰，本试验采用串联质谱的多反应监测（MRM）模式检测，具有良好的选择性和抗干扰能力，方法可在6 min内实现目标物的准确定性和定量，满足市售实际样品的检测需求。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

UPLC-MS/MS ACQUITYTM-XevoTMTQ MS超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：美国Waters公司；5418高速离心机：德国Eppendorf公司；MS3 basic涡旋振荡器：德国IKA公司；Milli-Q去离子水发生器：美国Millipore公司。

绿原酸（Chlorogenic acid，CAS327-97-9，纯度95%）、奎宁酸（D-Quinic acid，CAS：77-95-2，纯度98%）、甘草苷（Liquirtin，CAS：551-15-5，纯度99%）、槲皮素（Quereetin，CAS：117-39-5，纯度 98%）、柚皮苷（Naringin，CAS：10263-47-2，纯度 98%）：德国 Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇：HPLC级，德国Merck公司；甲酸：HPLC级，德国CNW公司；超纯水（18.2 MΩ）。

5种标准物质用少量水溶解后，加入甲醇定容，配制成单标标准储备液；分别吸取适量的单标标准储备液，用甲醇逐级稀释成10.0 mg/L的混合标准溶液，4℃避光保存，临用前用甲醇稀释成所需浓度的混合标准工作液。

5份市售分析样品：3份自制凉茶购自广州市散装凉茶零售店；1份干粉状凉茶购自网络；1份预包装植物凉茶饮料购自广州市内超市。

1.2 供试溶液的制备

取适量凉茶样品，13 000 r/min高速离心5 min，吸取1.0 mL上清液，加入甲醇稀释并定容至10 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，供UPLC-MS/MS测定。

凉茶干粉按说明书所述比例，用超纯水冲制成凉茶溶液后，按上述方法进行供试液的制备。

1.3 仪器条件

色谱柱：BEHC18色谱柱，100mm×2.1mm，1.7μm；流动相：A.0.1%甲酸水溶液（体积分数），B.乙腈，梯度洗脱程序：0.0 min～4.0 min，80% ～5%A；4.0 min～5.0 min，5%A；5.0 min ～5.1 min，5%～80%A。流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL；柱温：30℃。5种待测物的保留时间见表1。

表1 5种待测物的保留时间和质谱分析条件Table 1 Retention time and MS parameters for the analysis of 5 target compounds

质谱条件：ESI负模式；毛细管电压1.5 kV；离子源温度150℃；去溶剂气温度400℃；去溶剂气：氮气，800 L/h；锥孔气：氮气，50 L/h；碰撞气：高纯氩气，0.15 mL/min；检测模式：多反应监测（MRM）模式；5种目标物监测离子对（m/z）及锥孔电压、碰撞能等参数见表1，每个离子对的驻留时间均为0.06 s。

2 结果和讨论

2.1 仪器条件的优化

5种目标物中，有机酸分子结构中含有羧基，黄酮类化合物分子结构中含有羟基，在ESI-电离方式下均可获得丰度较高的脱氢准分子离子峰[M-H]-，对各目标物分别优化锥孔电压使各母离子丰度达到最大。对确定的母离子进行二级质谱扫描，各目标物的质谱裂解途径见表2。根据欧盟2002/657/EC指令的要求，每种化合物（除绿原酸外）均选择2个特征碎片离子作进行定量和定性，通过优化碰撞能，使特征碎片离子丰度达到最大，经优化的质谱参数见表1。

表2 5种目标物的质谱裂解途径Table 2 Fragmentation pathways of 5 target compounds

试验比较了 BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和 BEH T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱对 5种待测物的分离效果（见图2），结果显示，目标物经T3柱分离后，绿原酸会出现分峰现象（分裂成Rt=2.47 min和 3.44 min），甘草苷（Rt=4.35）和柚皮苷（Rt=4.47）不能完全分离；经C18柱分离后，各目标物能实现完全分离，峰型尖锐，响应较高。因此，选择BEH C18色谱柱分离。

比较了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水（体积分数）和乙腈-10 mmol/L乙酸铵3组流动相体系对目标物响应和分离效果的影响。由于有机酸中的羧基可与色谱柱固定相中的硅醇残基发生相互作用，在使用乙腈-水体系作为流动相时，奎宁酸和绿原酸等有机酸的色谱峰出现分裂或变宽拖尾现象；尽管在ESI-电离模式下，使用酸性的流动相体系会抑制目标物的电离，导致响应降低，但各目标物峰形较好，尤其是乙腈-甲酸体系，目标物峰形尖锐对称。比较了甲醇和乙腈作为有机相对目标物洗脱的影响，结果显示，采用乙腈洗脱，目标物的分离效果和峰形均优于甲醇体系，因此，选择乙腈-0.1%甲酸水（体积分数）作为流动相体系。通过优化梯度洗脱程序，使各目标物的分离效果和响应值达到最佳，目标物标准溶液在优化的仪器条件下的总离子流色谱图见图3。

图2 不同色谱柱对待测物的分离效果Fig.2 Separation result of different column

图3 目标物的总离子流色谱图Fig.3 TIC chromatogram of target compounds

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系和检出限

按 1.1 配制浓度分别为 0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mg/L的系列目标物混合标准工作溶液。按本试验确定的仪器条件（1.3）进行测定，以各目标物峰面积为纵坐标（y），以相应的质量浓度为横坐标（x）作标准曲线，获得各目标物的线性方程及相关系数。

对凉茶样品进行加标，经前处理后对样液进行检测，根据信号噪音比3（S/N=3）和稀释倍数计算方法检出限（LOD）。

5种目标物的线性方程、相关系数和方法检出限见表3。可见，各目标物在0.02 mg/L～0.5 mg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 0；方法检出限为 0.2 mg/L～0.5 mg/L。

2.2.2 方法回收率和精密度

选取凉茶样品进行3个浓度水平的加标试验，每个浓度平行6次，计算方法回收率和精密度，结果见表4。

表3 目标物的线性方程、相关系数、方法检出限Table 3 Equation of linear correlation，correlation coefficient and the method detection limit（LOD）of target analytes

表4 回收率和精密度测定结果（n=6）Table 4 Determination results of recoveries and precisions（n=6）

在添加浓度范围内，5种目标物的平均回收率为86.3%～102%；相对标准偏差（RSD，n=6）为2.4%～8.7%。

2.3 实际样品检测

利用建立的方法，对市售5份凉茶样品进行测定，每个样品重复测定3次，以验证方法的适用性，各样品中有机酸和黄酮类化合物的含量见表5，所测5份样品均检出了奎宁酸和绿原酸，4份样品含有甘草苷，1份样品含有柚皮苷，均未检出槲皮素。其中样品3（感冒茶）的总离子流色谱图见图4。

表5 样品中目标物的测定情况Table 5 Determination reslults of target compounds in samples

3 结论

本试验建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时测定凉茶中5种有机酸和黄酮类化合物的方法，样品经高速离心后，用甲醇稀释，过滤，UPLC-MS/MS电喷雾负离子电离，多反应监测模式检测，目标物以保留时间和特征离子对定性，外标法定量。本方法前处理过程简单，抗干扰能力强，适用于凉茶等植物饮料中有机酸和黄酮类化合物的检测。

图4 实际样品的总离子流色谱图Fig.4 TIC chromatogram of real sample

[1]游飞祥,韩彦琪,龚苏晓,等.HPLC-Q-TOF-MS分析植物凉茶中的化学成分[J].食品研究与开发,2016,37(8):161-165

[2]梁慧,邓洁薇,杨运云.高效液相色谱-质谱法对癍痧凉茶的化学成分鉴定及指纹图谱研究[J].分析测试学报,2014,33(2):144-149

[3]陈意光,邓穗兴,柯振华,等.高效液相色谱法同时测定果汁中13种有机酸和白藜芦醇[J].现代食品科技,2010,26(12):1387-1390

[4]施超欧,姚宝龙,胡咪,等.离子转换色谱-紫外检测法测定啤酒中的无机阴离子和有机酸[J].色谱,2016,34(10):951-955

[5]徐慧敏,施婷婷,檀华蓉,等.高效液相色谱法同时测定蔬菜中有机酸与磺胺类抗生素[J].分析试验室,2016,35(10):1135-1139

[6]王波,周围,刘小花,等.基于超高效合相色谱对黄芪中5种主要黄酮类化合物的快速检测[J].分析化学,2016,44(5):731-739

[7]Abdelrahman S Z,Nattha P,Áurea A,et al,Chenyu D.A.A new HPLC method for simultaneously measuring chloride,sugars,organic acid and alcohols in food samples[J].Journal of Food Composition and Analysis,2017,56:25-33

[8]Xiujuan X,Dan Z,Wei Z,et al.Microwave-assisted aqueous twophase extraction coupled with high performance liquid chromatography for simultaneous extraction and determination of four flavonoids incrotalariasessilifloraL[J].Industrial Crops and Products,2017,95:632-642

[9]熊治渝,董英,周洪斌,等.在线富集离子色谱-质谱联用发同时测定饲料添加剂中的16种有机酸[J].色谱,2014,32(2):145-150

[10]彭振磊,张育红,王川.石化废水中低碳有机酸的毛细管电泳分析[J].分析试验室,2015,34(7):850-854

[11]Magiera S,Uhlschmied C,Rainer M,et al.GC-MS method for the simultaneous determination of β-blocker,flavonoids,isoflavones and their metabolites in human urine[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2011,56:93-102

Quantitative Analysis of Organic Acid and Flavonoid in Herbal Tea by UPLC-MS/MS

HAN Wan-qing，WANG Bin，WANG Li，XIAN Yan-ping*
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Guangzhou），Guangzhou Key Laboratory of Detection Technology for Food Safety，Guangzhou Research Centre of Risk Dynamic Detection and Early Warning for Food Safety，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

A method for quantitative analysis of 5 kinds of organic acid and flavonoid compounds in herbal tea by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）was developed.Samples were centrifuged，diluted with methanol，and separated on BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column with acetonitrile-0.1%formic acid solution as mobile phase by gradient elution.Quantitative analysis was performed by a triple quadrupole MS system with negative electrospray ionization（ESI-）operated under multiple reaction monitoring（MRM）mode.The method showed a good linearity with correlation coefficients（r）larger than 0.999 0 at the concentration of 0.02 mg/L-0.5 mg/L.The limits of detection（LOD）of the method ranged 0.2 mg/L-0.5 mg/L.At the spiked level of 1.0 mg/L-40 mg/L，the average recoveries presented 86.3%-102%，with the relative standard deviation（RSD，n=6）values varied between 2.4%-8.7%.

herbal tea；organic acid；flavonoid；ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.025

广东省质监局科技计划项目（2015CZ13）；广州市质监局科技计划项目（2015kj01）

韩婉清（1987—），女（汉），工程师，硕士，从事产品质量安全检测研究。

*通信作者

2017-01-20