响应面与酶法优化拐枣膳食纤维的提取工艺

卢忠英，王云洋，鲁道旺，陈仕学，姚元勇

（铜仁学院材料与化学工程学院，贵州铜仁554300）

响应面与酶法优化拐枣膳食纤维的提取工艺

卢忠英，王云洋，鲁道旺，陈仕学*，姚元勇

（铜仁学院材料与化学工程学院，贵州铜仁554300）

以拐枣为试验材料，采用酶法对可溶性膳食纤维进行提取。在酶解温度、酶解时间、pH值、酶用量4个单因素试验基础上，利用Box-Behnken的中心组合设计原理进行响应面设计优化提取工艺参数。结果表明：拐枣中可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）得率最佳提取工艺条件为酶解温度60℃，酶解时间70 min，pH值为5.0，酶用量0.6%。拐枣中SDF得率可达14.22%，与SDF的提取理论值比较，其相对误差约为0.42%，且重复性好，说明响应面法建立的数学模型对拐枣中SDF提取具有稳定可靠性。

拐枣；可溶性膳食纤维；提取工艺；响应面

拐枣（Hovenia dulcis）学名枳椇，俗称万寿果，鸡爪李，是枳椇属鼠李科枳属植物，食用部分是果柄，属于药食同源植物之一，在我国已有1500多年历史[1]。拐枣食用部位营养价值丰富，据资料显示，富含生物活性成分多样，有拐枣多糖、苹果酸钙、蛋白质、维生素、有机酸、矿物质及黄酮类等活性物质，具有一定的营养保健功能[2-4]。《本草纲目》中记载：枳椇味甘、性平、无毒，止渴除烦，去膈上热，利大小便，功效同蜂蜜。据报道，拐枣提取物有解酒毒，具有促进尿液排泄，健胃消食，提高免疫力等作用[5-6]。

膳食纤维（dietary fiber，DF）是一类特殊的碳水化合物，不能被人体消化道酶分解的多糖类的总称，因其具有重要的生理功能，是人体不可缺少营养素。根据其溶解性质分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）[7-8]，可溶性膳食纤维在抗氧化、防治心血管疾病、糖尿病、肥胖等方面效果显著[9-10]。拐枣中膳食纤维的提取工艺鲜为报道，本文以拐枣为试验材料，采用酶法提取拐枣中的SDF，并结合响应面（responsesurface methodology，RSM）法对其工艺条件进行了优化，为提高拐枣的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

拐枣采自贵州省铜仁市印江县永安乡，50℃烘干，粉碎成细粉，采用石油醚70℃浸泡1 h，连续回流2次，3 h/次，脱脂和去色素后过滤，滤渣60℃烘干，备用。

纤维素酶（活力值：15 000 U/g）：上海丹尼悦生物科技有限公司；95%乙醇（分析纯）、氢氧化钠、乙醇、盐酸：成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器

FW80型万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；JJ-500精密电子天平：上海恒平科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计：雷磁仪器厂；RE52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：上海千载科技有限公司；DHG-9036A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精密科学仪器有限公司；TD5A台式低速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDF提取工艺流程

脱脂样品→蛋白酶→加压灭酶→纤维素酶→灭酶→浓缩→醇提→离心过滤→干燥→成品SDF

1.3.2 操作要点

取10.00 g脱脂样品，按1∶20（g/mL）料液比加水，在高压灭菌锅中进行加压预处理3.5 h，在60℃下恒温水浴，在一定pH值的缓冲液中加纤维素酶进行提取，过滤，重复一次；合并提取上清液并在3 500 r/min转速下离心30 min，取上清液，加入4倍体积的无水乙醇对滤液进行处理，静置过夜，用已干燥至恒重的滤纸抽滤。将滤纸及沉淀物置于60℃干燥箱中干燥恒重为止，计算得率。SDF的测定方法[11]。公式为：

拐枣SDF得率/%=（滤纸及沉淀物置于60℃烘箱中干燥至恒重-干燥至恒重的定量滤纸）/1.00（g）×100

1.3.3 单因素试验设计

设定溶液pH值为5.0、酶解时间70 min、酶用量0.6%，考察酶解温度在 50、55、60、65、70、75 ℃对 SDF得率的影响；设定溶液pH值为5.0、酶用量0.7%、酶解时间 60 min，考察酶解时间在 40、50、60、70、80、90 min对SDF得率的影响；每个单因素设3次重复试验。设定酶用量0.6%、酶解时间70 min、酶解温度60℃，考察溶液 pH 值在 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 对 SDF 得率的影响；设定溶液pH为5.0、酶解时间70 min、酶解温度60℃，考察酶用量0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%对SDF得率的影响。

1.3.4 响应面试验

以单因素试验结果为依据，按Box-Behnken Design中心组合试验设计原理，以酶解温度、酶解时间、pH、酶用量为自变量，以拐枣中SDF得率为响应值，采用四因素三水平的响应面分析方法求取优化的工艺参数[12]，试验因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table 1 The factors，levels and codes of Box-Behnken design

1.4 数据分析处理

单因素试验数据用Microsoft Office Excel2007分析作图。响应面优化试验数据采用Design-ExpertV8.0进行分析处理和作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 酶解温度对拐枣SDF得率的影响

酶解温度对拐枣SDF得率的影响见图1。

图1 酶解温度对拐枣SDF得率的影响Fig.1 Effects of enzymolysis temperature on the rate of Hovenia dulcis SDF

如图1所示，酶解温度50℃～60℃范围内SDF得率随酶解温度的上升而增大，在60℃达到最大，当酶解温度继续升高，SDF得率却逐渐下降，分析由于纤维素酶在一定温度范围内，酶解温度越高，活性越强，作用SDF分子越强，易于SDF的溶出，但温度过高也会降低酶活性，甚至使酶失活。因此，最佳酶解温度60℃为宜。

2.1.2 酶解时间对拐枣SDF得率的影响

酶解时间对拐枣SDF得率的影响见图2。

图2 酶解时间对拐枣SDF得率的影响Fig.2 Effects of enzymolysis time on the rate of Hovenia dulcis SDF

由图2可知，在40 min～60 min内，拐枣SDF得率增加幅度较小，可能酶解时间过短，使提取SDF不彻底；当酶解时间在60 min～70 min时，随着时间延长，拐枣中大部分SDF被纤维素酶酶解出来，使SDF得率显著上升，在70 min时SDF得率达到最大，分析原因可能纤维素酶使细胞壁破裂致多糖类物质大量溶出，增大拐枣SDF得率，继续延长酶解时间，使果胶发生酯解、裂解反应，使SDF得率略有下降。因此，最佳酶解时间在70 min为宜。

2.1.3 pH值对拐枣SDF得率的影响

pH值对拐枣SDF得率的影响见图3。

图3 pH值对拐枣SDF得率的影响Fig.3 Effects of pH on the rate of Hovenia dulcis SDF

由图3可知，pH值在3.5～4.5范围内，拐枣SDF得率缓慢上升；当pH值在4.5～5.0范围内，拐枣SDF得率显著上升，当pH值为5.0时，拐枣SDF达到最大，分析可能是pH过小或过大时，影响了纤维素酶活性，因此最佳pH值控制在5.0为宜。

2.1.4 酶用量对拐枣SDF得率的影响

酶用量对拐枣SDF得率的影响见图4。

图4 酶用量对拐枣SDF得率的影响Fig.4 Effects of enzyme dosage on the rate of Hovenia dulcis SDF

由图4可得，增加纤维素酶用量，拐枣SDF得率增大，当酶用量增至0.6%时，拐枣中SDF得率达到最大值，继续增加酶用量，SDF得率不再增加，分析原因可能由于增加酶用量，使部分IDF降解，继续用浓醇沉淀时不能沉淀，从而使SDF得率下降。因此选酶用量应在0.6%为宜。

2.2 拐枣SDF提取工艺优化

2.2.1 数学模型的建立与检验

以单因素试验结果为依据，采用Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken设计，SDF提取试验设计方案及结果见表2，回归方差分析见表3。拟合所得多元二次回归方程如下：Y=14.24A-0.25B+0.59C+0.27D-0.25AB+0.045AC-0.045AD-0.14BC-0.46BD+0.055CD-3.21A2-2.76B2-3.28C2-2.88D2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

续表2 响应面试验设计及结果Continue table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

由表3数据显示，模型P值＜0.000 1，说明该模型达到极显著水平，同时失拟项P值为0.8097，大于0.05，说明模型的预测值和实际值非常吻合，模型成立。相关系数R2=0.995 6，说明响应值的变化有99.56%来源于所选变量[13]，该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以用其确定最佳提取工艺条件。此外，各因素中一次项B、C、D及二次项A2、B2、C2、D2对 SDF 得率均表现出了差异显著水平，AB、BD交互作用的影响差异显著（p＜0.05），因此，各因素对SDF得率的影响大小顺序为pH＞酶用量＞酶解时间＞微波功率。

2.2.2 各交互项对SDF得率影响的分析

各交互项对SDF得率影响的分析见图5。

由图5各响应面可以看出，随着各因素的增大，响应值逐渐增大；其中BD的响应面曲线陡峭，对SDF得率影响显著，AB的响应面曲线仅次于BD、AC、BC、AD、CD响应面曲线较平缓，SDF得率影响不显著，与方差分析一致。

图5 各两因素交互作用的响应面Fig.5 Response surface and contour plots for pairwise factors interaction

2.3 工艺优化与验证试验

根据响应面试验设计及结果分析，得到影响拐枣SDF得率的理论最佳条件为：酶解温度60.02℃，酶解时间69.47 min，pH值为5.05，酶用量0.61%，其拐枣SDF得率14.28%。为检验响应面优化结果的可靠性，考虑试验操作的可行性，分别取各因素的整数值，酶解温度60℃，酶解时间70 min，pH值为5.0，酶用量0.6%。在此最优条件下进行3次验证试验，拐枣SDF得率可达14.22%，与SDF的提取理论值比较，其相对误差约为0.42%，且重复性也很好，因此该优化提取工艺参数准确可靠。

3 结论

本文采用响应面优化酶法提取拐枣中SDF，结果表明：拐枣中SDF得率的最佳提取工艺条件为酶解温度60℃，酶解时间70 min，pH为5.0，酶用量0.6%。拐枣中SDF得率可达14.22%，与SDF的提取理论值比较，其相对误差约为0.42%，且重复性也很好，说明响应面法建立的数学模型对拐枣中SDF提取具有稳定可靠性。

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Optimization Extraction of Dietary Fiber from Hovenia dulcis by Enzymolysis and Response Surface Methodology

LU Zhong-ying，WANG Yun-yang，LU Dao-wang，CHEN Shi-xue*，YAO Yuan-yong
（Institute of Material and Chemical Engineering，Tongren University，Tongren 554300，Guizhou，China）

The soluble dietary fiber were extracted from Hovenia dulcis with the enzymolysis and response surface methodology.Based on the single factor experiments，Box-Behnkencentral composite design principles were used to select enzyme temperature，pH，enzyme time and dosage as four parameters of response surface design to optimize extraction process.The results showed that the optimum extraction conditions of the extraction rate of Hovenia dulcis SDF enzyme temperature 60 ℃ ，pH 5.0，enzyme time 70 min and enzyme dosage 0.6%.The extraction rate of soluble dietary fiber reached 14.22%，compared with the theoretical value，the relative error was about 0.42%，and the repeatability was also very good，that was to say using the model of response surface extracting the Hovenia dulcis SDF was stability and reliability.

Hovenia dulcis；soluble dietary fiber；extraction technology；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.006

梵净山特色苗药资源保护与开发产学研基地（黔教合KY字[2014]233）；教育厅省级重点支持学科（黔学位合字ZDxk[2015]34号）

卢忠英（1987—），女（苗），讲师，硕士，研究方向：天然药物化学成分与新药研发。

*通信作者：陈仕学（1979—），教授，硕士，研究方向：天然药物化学成分与新药研发。

2017-01-16