9个产地夏枯草主要化学成分的比较分析*

徐 锐，张雪绒，郭巧生Δ，刘 丽，赵 淼，秦 琴, 陈宇航,Δ.成都医学院 药学院(成都 60500)；．南京农业大学 中药材研究所(南京 0095)

·论著·

9个产地夏枯草主要化学成分的比较分析*

徐 锐1，张雪绒2，郭巧生2Δ，刘 丽2，赵 淼1，秦 琴1, 陈宇航1,2Δ
1.成都医学院 药学院(成都 610500)；2．南京农业大学 中药材研究所(南京 210095)

目的对9个产地夏枯草的主要化学成分进行测定，并进行主成分分析和聚类分析。方法用分光光度计法测定夏枯草多糖和总黄酮含量，HPLC法测定迷迭香酸含量。结果9个产地夏枯草多糖含量在6.81%～12.49%，总黄酮含量在3.29%～5.82%，迷迭香酸含量在1.0%～3.3%。夏枯草的主成分为多糖，聚类结果显示地理位置相近的聚为一类。结论9个产地夏枯草的主要化学成分含量比较，差异具有统计学意义，建议夏枯草质量评价应结合多糖含量。

夏枯草；多糖；总黄酮；迷迭香酸；主成分分析；聚类分析

夏枯草为唇形科植物夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗，为我国常用中药材，具有清肝泻火，明目，散结消肿等功效[1]。现代研究表明，夏枯草含有多种活性成分，主要有黄酮类、甾醇类、三萜类、脑苷脂类等化合物[2]，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性[3-6]。夏枯草分布地区广泛，主产区有江苏、浙江、河南、安徽等地。不同的生态环境会导致药材的成分含量不同，进而影响药材的质量。本研究采用分光光度计法测定9个产区夏枯草多糖和总黄酮含量，HPLC法测定迷迭香酸含量，用主成分分析法和聚类分析法对9个产区的夏枯草质量进行比较分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器和试剂

Alpha-1900S 紫外-可见分光光度计(上海潽元仪器有限公司)；旋片式真空泵(上海博尔康真空电子有限公司)；电热恒温水浴锅(上海虞龙仪器设备有限公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；打粉机(上海霸辉工具有限公司)；FL2200-高效液相色谱仪(浙江福立分析仪器有限公司)；超声波清洗器(北京科玺科技有限公司)；Rios纯水器(密理博上海贸易有限公司)。

0.305 mg/mL葡萄糖对照品：精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品30.50 mg，加入适量蒸馏水溶解于100 mL容量瓶中定容，摇匀备用；0.014 mg/mL芦丁对照品：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品2.10 mg，加入适量30%乙醇溶解，并于150 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀备用；0.530 mg/mL迷迭香酸对照品：精密称取干燥至恒重的迷迭香酸对照品5.30 mg，置于10 mL容量瓶中，加入适量95%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀备用。其中葡萄糖对照品(批号：20130222)购于天津博迪化工股份有限公司，芦丁对照品(批号：141208)和迷迭香酸对照品(批号：151203)购于成都普菲德生物技术有限公司，石油醚、苯酚、乙醇、浓硫酸、亚硝酸钠、氯化铝和氢氧化钠等均为市售分析纯，甲醇为国产色谱纯，试验用水为超纯水。

供试夏枯草药材分别购于湖北省广水县、陕西省汉阴县、浙江省丽水市、河南省舞钢市、贵州省瓮安县、广西省贺州市、广东省连南县、福建省宁化县和湖南省张家界9个产地(表1)，经成都医学院药学院李羿教授鉴定，为唇形科植物夏枯草P.vulgarisL.的干燥果穗。

1.2方法

1.2.1 夏枯草多糖的提取和含量测定[7]精密称取干燥粉碎后的夏枯草粉末0.5 g，置于索氏提取器中，加95%乙醇在90 °C索氏提取3 h，阴干；加入适量石油醚在80 ℃索氏提取2 h，回收石油醚，阴干；将残渣以固液比(1∶65)加入适量蒸馏水，在95 °C恒温水浴提取3 h，抽滤，冷却，滤液置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀；取5 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得到供试液。

y=0.014 1x +0.000 6+e R2=0.988 9

(1)

式中：y为对应的吸光度值；x为样品葡萄糖的浓度。

多糖含量(%)=f×c×D×V/W×100%

(2)

式中：f为换算因子(f=1.96)；c为样品葡萄糖的浓度(mg/mL)；D为稀释倍数；V为供试液体积(mL)；W为供试品重量(mg)。

表1 夏枯草样品的收集地与来源

1.2.2 夏枯草总黄酮的提取和含量测定[8]精密称取干燥粉碎后的夏枯草粉末0.5 g，于锥形瓶中，加入35%乙醇20 mL，密封摇匀；86 °C水浴恒温提取3.5 h；将锥形瓶取出并冷却至室温，称重，补液；抽滤，用微孔滤膜过滤，滤液用35%乙醇定容至25 mL，摇匀，得到供试液。

以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法绘制标准曲线。精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL后加30%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min，在510 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，得回归方程式(3)。将夏枯草总黄酮供试液用上述方法在510 nm处测定吸光度，总黄酮含量按式(3)计算。

y=11.500x+0.038 5+e R2=0.987 5 (3)

竹韵有些犯难了，自己跟海力不过是普通主雇关系，上班拿了工资奖金，岂能再收他如此贵重的礼物？从马丽亚眼里的敌视来看，她已经隐隐感觉出了些什么。但是，不收又如何拒绝呢？何不暂时把电脑收下，今后努力工作来回报公司，或者今后用工资付帐也行，其实她也早就想给龙斌买台电脑了。想到这里，她伸手接过电脑，脸上也露出了笑容。

式中：y为对应的吸光度值；x为总黄酮含量。

1.2.3 夏枯草迷迭香酸的提取和含量测定[9]精密称取干燥粉碎后的夏枯草粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入70%乙醇50 mL，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45 μM的微孔滤膜过滤，滤液即为供试液。

以迷迭香酸为标准品，采用高效液相法绘制标准曲线。色谱条件为：色谱柱：岛津ODS18柱；流动相：甲醇-0.1%甲酸(42∶58)；流速：0.6 mL/min；波长：330 nm；注温：25 °C；进样量：10 μL。精密吸取迷迭香酸对照品溶液2、4、6、8 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的进样量x(μL)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制出标准曲线，得迷迭香酸回归方程式(4)。分别精密吸取不同产地夏枯草迷迭香酸供试液10 μL，每组样品重复进样3次，按上述方法测定峰面积数值，迷迭香酸含量按式(5)计算。

y=4.1E+6x-5.1E+6 R2=0.994 1 (4)

式中：y为对应的吸光度值；x为对照品的进样量。

含量=CR×AX/AR(5)

式中：CR为对照品浓度；AX为供试品峰面积；AR为对照品峰面积。

1.3统计学方法

2 结果

2.1不同产地的夏枯草果穗中成分的含量分析

不同产地夏枯草果穗中成分含量测定结果表明，所测定9个地区的的夏枯草果穗多糖含量在6.81%～12.49%，不同产地的夏枯草药材其果穗中的多糖含量不一致。其中，广西省贺州市多糖含量为12.49%，河南省舞钢市多糖含量为12.01%，皆明显高于其他产区，而陕西省汉阴县多糖含量较低，只达到6.81%；总黄酮含量在3.29%～5.82%，不同产地的夏枯草果穗总黄酮含量也不一致。其中，福建省宁化县总黄酮含量最高，达到了5.82%，而广东省连南县总黄酮含量低于其他地方，只有3.29%；迷迭香酸含量在1.0%～3.3%，不同产地的夏枯草果穗迷迭香酸含量也不一致，广西省贺州市迷迭香酸含量为3.3%，明显高于其他产区，浙江省丽水市迷迭香酸含量较低，只有1.0%(表2)。

表2 不同产地夏枯草的主要化学成分含量

2.2主成分分析

主成分分析结果表明，夏枯草果穗主要成分是多糖，多糖特征值为1.94，方差累积贡献率为64.69%。其中，广西省贺州市得分最高，多糖含量为12.49%。按照药典的规定，质量最优的也是广西省贺州市，迷迭香酸含量达到3.3%，明显高于其他产区。由此可以得出，在对夏枯草进行质量评价时，可以结合多糖含量(表3)。

表3 主成分分析解释

注：提取方法：主成分分析

2.3聚类分析

聚类分析表明，陕西省汉阴县和贵州省瓮安县是单独的；广西省贺州市和广东省连南县聚为一类；湖北省广水县、浙江省丽水市、河南省舞钢市、福建省宁化县、湖南省张家界聚为一类。地理位置相近的聚为一类，证明夏枯草果穗中化学成分含量和生态环境有关，包括气候、土壤、日照、地形等因子；同时也和采收期等其他因素有关(图1)。

图1 不同产地夏枯草聚类分析图

3 讨论

本研究认为不同产地的夏枯草多糖、总黄酮和迷迭香酸含量存在明显差异，是由于地理位置、光照、气候、海拔、采收期等[10-11]多种因素的影响。通过聚类分析表明，陕西省汉阴县和贵州省瓮安县是单独的；广西省贺州市和广东省连南县聚为一类；湖北省广水县、浙江省丽水市、河南省舞钢市、福建省宁化县、湖南省张家界聚为一类。地理位置相近的聚为一类，这与前人的研究具有一致性[12]。依据中国药典的规定，试验中9个产地夏枯草质量最优是广西省贺州市；如果参考夏枯草多糖的含量，质量最优的也是广西省贺州市。研究[13]证明，夏枯草各成分间的结构比与药效紧密相关，所以单一的化学成分含量不足以证明该中草药的药用价值。对一种中草药的药用价值进行评价时，应结合该种中草药的几种主要化学成分进行综合分析。不同研究[14-18]表明，多糖有较好的抗氧化、免疫和抗癌细胞增殖作用，夏枯草多糖的结构和组成的差异可能与夏枯草的产地、物种类别和分离纯化方法等差异有关。

综上所述，本研究认为在对夏枯草药材质量进行评价时，应在考虑主要成分迷迭香酸含量的同时，再结合多糖的含量进行评价。

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ComparisonandAnalysisoftheMainChemicalComponentsofPrunellaVulgarisL.CollectedfromNineDifferentPlaces

XuRui1,ZhangXuerong2,GuoQiaosheng2Δ,LiuLi2,ZhaoMiao1,QinQin1,ChenYuhang1,2△.
1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.InstituteofChineseMedicinalMaterials,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210059,China

Objective To determine the main chemical components of the Prunella vulgaris L. collected from nine different places and carry out the principal component analysis and cluster analysis.MethodsThe polysaccharides and total flavonoids of Prunella vulgaris L. were determined by spectrophotometer and the rosmarinic acid was determined by HPLC.ResultsThe content of polysaccharides, total flavonoids and rosmarinic acid in the Prunella vulgaris L. collected from nine different places was 6.81%～12.49%, 3.29%～5.82%, and 1.0%-3.3% respectively. The polysaccharides proved to be the main chemical component of Prunella vulgaris L. The results of clustering analysis showed that the Prunella vulgaris L. with geographical proximity could be clustered together.ConclusionThere are significant differences among the Prunella vulgaris L. collected from nine different places in the main chemical components, so it is suggested that the content of Prunella vulgaris L. should be considered in the quality the quality evaluation of Prunella vulgaris L.

Prunella vulgaris L.; Polysaccharides; Total flavonoids; Rosmarinic acid; Principal component analysis; Cluster analysis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170525.1148.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.005

R282.71

A

国家自然科学基金项目(No:31500263；30772730；81072986); 国家中医药管理局中医药行业科研专项(No:201507002)；中国博士后科学基金(No:2014M560726；2016T90869)；国家级大学生创业项目(No:201413705026)；成都医学院大学生创新实验项目(No:CXXS201417)

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郭巧生, E-mail：gqs@njau.edu.cn；陈宇航，E-mail：chenyuhang221@126.com