3个引进油橄榄品种初榨油多酚类化合物含量及抗氧化活性研究

向春蓉 徐 洲 王寒冬 刘 捷 丁春邦 李 天 杨泽身(四川农业大学生命科学学院，雅安 6504)( 四川农业大学农学院，成都 60)(凉山州中泽新技术开发有限责任公司，西昌 65000)

3个引进油橄榄品种初榨油多酚类化合物含量及抗氧化活性研究

向春蓉1徐 洲1王寒冬1刘 捷1丁春邦1李 天2杨泽身3
(四川农业大学生命科学学院1，雅安 625014)( 四川农业大学农学院2，成都 611130)(凉山州中泽新技术开发有限责任公司3，西昌 615000)

以3个引进油橄榄品种初榨油为材料，测定总多酚含量和各单体酚含量并评价其抗氧化活性，同时采用SPSS应用软件分析总多酚含量、各单体酚含量与体外抗氧化活性的相关性。结果表明：3个品种总多酚含量分别为21.26、23.31、26.04 μg/g，品种间无显著差异，而单体酚含量均较少；3个品种中佛奥对DPPH自由基的清除能力最强，而对羟基自由基的清除能力和Fe2+螯合能力则是豆果最强；羟基酪醇含量与DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力极显著负相关或显著正相关，相关系数分别为-0.956、0.713、0.721；对羟基苯甲酸含量与Fe2+螯合能力显著正相关；槲皮素含量与DPPH自由基清除能力显著负相关，与Fe2+螯合能力显著正相关；而总多酚含量、咖啡酸和表儿茶素含量与体外抗氧化能力的的相关程度较低，因此羟基酪醇、对羟基苯甲酸和槲皮素是主要的抗氧化成分。

初榨橄榄油 多酚含量 抗氧化活性

初榨橄榄油是油橄榄鲜果经物理冷榨而得的植物油，含有丰富的不饱和脂肪酸、α-生育酚、多酚、甾醇以及多种微量元素[1]。多酚类化合物指芳香烃中苯环上一个或多个氢原子被羟基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代谢产物，包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等，能作为天然的抗氧化剂阻止活性氧和活性氮的增加，调节机体内氧化剂和抗氧化剂的稳态，防止或减弱生物大分子的氧化损伤，从而达到降低许多慢性疾病的发病率以及延缓衰老的作用[2-3]。橄榄油中主要的多酚类化合物有没食子酸、羟基酪醇、阿魏酸、儿茶素和咖啡酸等，能提高橄榄油的氧化稳定性，延长橄榄油的货架期，提高橄榄油的色泽、风味等感官特性[4-6]。研究还表明，橄榄油中的多酚类化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等多种生物活性[7]。

以凉山地区引进的3个油橄榄品种初榨油为对象，利用高效液相色谱(HPLC)技术及SPSS分析软件，研究其多酚类化合物含量和抗氧化活性以及二者之间的相关性，以期为橄榄油品质分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

3个品种初榨橄榄油(佛奥、豆果、城固32)：凉山州中泽新技术开发有限责任公司；各单体酚标准品，2，2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)：美国Sigma公司；甲醇(用于流动相)、异丙醇：色谱纯，美国Fisher公司；甲醇、啡啰嗪、水杨酸钠、H2O2、FeSO4、乙醇、醋酸：分析纯，成都科龙化工试剂厂。

GL-2050M高速冷冻离心机：湖南赛特湘仪器；RE-2000B旋转蒸发仪：上海荣亚生化仪器；Agilent 1260型高效液相色谱系统：美国Agilent公司；Spectramax M2酶标仪：美国Molecular Devices公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多酚类化合物的制备

多酚类化合物的制备参照Bouarroudj[8]的方法，稍有改动：20.0 g橄榄油溶解于80%甲醇溶液中，振摇1 min，4 000 r/min离心15 min，收集上层液体，重复提取3次后于40 ℃浓缩，80%甲醇溶液定容至25 mL，得样品溶液。

1.2.2 总多酚含量的测定

总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteau显色法[9]，稍加改动：先将样品溶液稀释20倍，取20 μL福林酚试剂加入到100 μL稀释后的样品溶液中，5 min后加入80 μL 10%碳酸钠溶液，摇匀，避光反应1 h后于765 nm检测。以没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。总多酚含量计算公式：

式中：C为样品液中总多酚质量浓度/μg/mL；V为样品液体积/mL；N为稀释倍数；M为橄榄油质量/g。

1.2.3 多酚类化合物组成分析及含量测定

标准溶液制备：分别称取适量的羟基酪醇、对羟基苯甲酸、咖啡酸、表儿茶素和槲皮素，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得标准品溶液。分别吸取一定量的标准品溶液，配成标准品混合液，在该混合液中各单体酚的质量浓度分别为：羟基酪醇11.98 μg/mL、对羟基苯甲酸28.46 μg/mL、咖啡酸11.48 μg/mL、表儿茶素38.95 μg/mL和槲皮素7.99 μg/mL。将标准品混合溶液依次稀释2.5、5.0、10.0、15.0、20.0倍后进样分析。以各单体酚液相色谱质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(mAu·s)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。各单体酚含量计算公式：

式中：C为样品液中各单体酚质量浓度/μg/mL；V为样品液体积/mL；M为橄榄油质量/g。

液相色谱条件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；DAD检测器；进样量20 μL；检测波长280 nm；柱温35 ℃；流量1.0 mL/min；流动相为0.5%乙酸(A)+甲醇(B)+异丙醇(C)；梯度洗脱顺序为0～14 min，92% A，4% B，4% C；14～30 min，92%～82% A，4%～9% B，4%～9% C；31～60 min，82%～70% A，9%～15% B，9%～15% C。

1.3 抗氧化活性测定

1.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参照李小勇等[10]报道的方法，稍加改动：先将待测液分别稀释1、5、10、15、20倍，取稀释后的样品溶液50 μL，加入150 μL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，摇匀，室温反应30 min后于517 nm测吸光值。DPPH自由基清除率通过公式计算:

式中：As为样品溶液的吸光值；Ac为乙醇代替样品溶液的吸光值。

1.3.2 羟基自由基清除能力测定

羟基自由基清除能力的测定参照Xu等[11]的报道，稍加改动：先将待测液分别稀释1、2、4、6、8倍，取稀释后的样品溶液50 μL，加入50 μL 9 mmol/L的水杨酸钠溶液和50 μL H2O2，摇匀，37 ℃反应30 min后于510 nm测吸光值。羟基自由基清除率通过公式计算:

式中：As为样品溶液的吸光值；Ac为蒸馏水代替样品溶液的吸光值。

1.3.3 铁离子螯合能力的测定

铁离子螯合能力的测定参照Pinar等[12]的报道，稍加改动：先将待测液分别稀释1、2、4、6、8倍，取稀释后的样品溶液50 μL，加入100 μL 0.012 5 mmol/L的FeSO4溶液和50 μL 1 mmol/L的啡啰嗪溶液摇匀，室温反应10 min后于562 nm测吸光值。铁离子螯合能力通过公式计算:

式中：As为样品溶液的吸光值；Ac为蒸馏水代替样品溶液的吸光值。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 20进行清除率达到50%时的浓度(EC50)的计算，相关性分析及显著性分析。数据均为3次重复的平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 总多酚和各单体酚的含量

分别以吸光值和峰面积为纵坐标，总多酚及各单体酚的质量浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程和相关系数(表1)，各物质的吸光值和浓度之间以及峰面积和浓度之间均呈良好的线性关系。3个品种初榨橄榄油的总多酚及各单体酚含量见表1，其中总多酚含量分别为21.26、23.31和26.04 μg/g，品种间无显著差异。据文献报道[13]，总多酚含量与橄榄油的抗氧化活性有着密切的联系。3个品种初榨橄榄油的各单体酚含量均较少，其中咖啡酸的含量最少。佛奥的羟基酪醇含量3.17 μg/g明显高于豆果和城固32，而表儿茶素的含量则低于豆果和城固32；城固32因较高的表儿茶素含量13.03 μg/g区别于另2个品种；豆果的槲皮素含量0.09 μg/g明显低于另2个品种。

表1 3个品种初榨橄榄油总多酚及各单体酚的含量、线性方程和相关系数(μg/g；n=3)

注：—表示低于定量限；同一行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，余同。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一种稳定的自由基，能与抗氧化剂结合形成稳定的DPPH分子并伴随着517 nm处特征峰的消失，因而被广泛用于多酚以及天然产物的抗氧化活性评价[14-15]。由图1可以看出，当稀释倍数小于10倍时，3个品种初榨橄榄油的多酚类化合物对DPPH自由基的清除率与稀释倍数呈现良好的量效关系，而当稀释倍数大于10倍时，DPPH自由基清除率随稀释倍数增加降低缓慢。3个品种清除DPPH自由基50%的质量浓度即EC50值分别为102.66、120.66和31.33 μg/mL(表2)，表明佛奥中多酚类化合物清除DPPH自由基能力最强，城固32次之，豆果最低。

图1 3个品种初榨橄榄油多酚类化合物的DPPH自由基清除能力

表2 清除率和螯合力达到50%时各品种的总多酚浓度 (μg/mL；n=3)

2.2.2 羟基自由基清除能力

羟基自由基是生物机体产生的活性高、毒性强的自由基，极易通过细胞膜而损伤脂质、蛋白质和DNA，因此羟基自由基清除率也是评价抗氧化剂的重要指标[16]。如图2所示，3个品种初榨橄榄油多酚类化合物对羟基自由基有良好的清除效果，当稀释倍数小于6倍时，佛奥多酚类化合物的羟基自由基清除率明显高于豆果和佛奥。3个品种清除羟基自由基50%的质量浓度即EC50值分别为24.66、20.00、32.33 μg/mL(表2)，表明豆果中多酚类化合物清除羟基自由基的能力最强，城固32次之，佛奥最低。

图2 3个品种初榨橄榄油多酚类化合物的羟基自由基清除能力

2.2.3 Fe2+螯合能力

图3 3个品种初榨橄榄油多酚类化合物的Fe2+螯合能力

多酚类化合物能与Fe2+形成螯合物而减少机体羟基自由基的产生，因此Fe2+螯合能力是评价多酚类化合物抗氧化能力的又一重要指标[17]。由图3可知，3个品种初榨橄榄油的多酚类化合物对Fe2+螯合率与稀释倍数呈现良好的量效关系，当稀释倍数为1倍时，Fe2+螯合率豆果>城固32>佛奥。3个品种Fe2+螯合50%的质量浓度即EC50值分别为10.00、5.66和13.33 μg/mL(表2)，表明豆果中多酚类化合物Fe2+螯合能力最强，城固32次之，佛奥最低。3个品种初榨橄榄油的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力与总多酚含量变化趋势不一致，可能与单体酚的种类和含量有关[18]。

2.3总多酚和各单体酚含量与体外抗氧化活性的相关性

总多酚和各单体酚含量与体外抗氧化活性的相关性系数见表3，DPPH自由基清除能力与羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力显著负相关，相关系数分别为-0.719和-0.762。羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力极显著正相关，相关系数为0.961。羟基酪醇含量与DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力极显著负相关或显著正相关，相关系数分别为-0.956、0.713和0.721；对羟基苯甲酸含量与Fe2+螯合能力显著正相关；槲皮素含量与DPPH自由基清除能力显著负相关，与Fe2+螯合能力显著正相关。总多酚含量、咖啡酸和表儿茶素含量与抗氧化能力相关程度较低。

表3 总多酚、各单体酚含量与体外抗氧化活性的相关性系数

注：-表示负相关；*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3 结论

本试验对3个品种初榨橄榄油的总多酚和各单体酚含量进行了分析测定，评价其体外抗氧化活性，并采用SPSS应用软件分析总多酚、各单体酚含量与体外抗氧化活性的相关性。结果表明，3个品种初榨橄榄油中存在多种单体酚，其含量品种间差异显著，而总多酚含量品种间差异较小；佛奥的多酚类化合物对DPPH自由基的清除能力最强，而对羟基自由基的清除能力和Fe2+螯合能力则是豆果最强；羟基酪醇、对羟基苯甲酸和槲皮素含量与抗氧化能力极显著或显著相关，而总多酚含量、咖啡酸和表儿茶素含量与体外抗氧化能力的的相关程度较低。因此羟基酪醇、对羟基苯甲酸和槲皮素是初榨橄榄油中的主要抗氧化成分。

[1]于长青.橄榄油的化学组成及对人体的营养价值[J].食品科技,2000(2)：59-60

Yu C Q.The chemical composition and nutritional value to human body of olive oil[J].FoodScience and Technology,2000(2)：59-60

[2]李学鹏,励建荣,杨建荣.苹果中多酚类物质HPLC检测方法的建立[J].中国食品学报,2008,8(6)：116-121

Li X P,Li J R,Yang J R.HPLC method establishment for apple polyphenolic materials determination[J].Journal of Chinese institute of Food Science and Technology,2008,8(6)：116-121

[3]范金波,蔡茜彤,冯叙桥，等.5 种天然多酚类化合物抗氧化活性的比较[J].食品与发酵工业,2014,40(7):77-83

Fan J B,Cai Q T,Feng X Q,et al.Comparison of antioxidant activities of 5 natural phenolic compounds[J].Food and Fermentation Industries,2014,40(7):77-83

[4]María I A F,Roberto R G,Antonia G F,et al.Analysis of phenolic compounds in olive oil by solid-phase extraction and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Food Chemistry,2012,134:2465-2472

[5]Romero S C,Garca R R,Sanchez O A,et al.The role of olive-glucosidase in shaping the phenolic fraction of virgin olive oil[J].Food Research International,2012,45,191-196

[6]向春蓉,邓俊琳,刘露，等.HPLC同时测定橄榄油中4种多酚类化合物的含量[J].中国油脂,2015,40(12):84-87

Xiang C R,Deng J L,Liu L,et al.Simultaneous determination of four polyphenolic compounds in the olive oils by HPLC[J].China Oils and Fats,2015,40(12):84-87

[7]Yang D P,Kong D X,Zhang H Y.Multiple pharmacological effects of olive oil phenols[J].Food Chemistry,2007,104(3):1269-1271

[8]Bouarroudj A K,Tamendjari R L,Larbat R.Quality,composition and antioxidant activity of Algerian wild olive(Olea europaea L.subsp.Oleaster)oil[J].Industrial Crops and Products,2016,83：484-491

[9]Gabriel B,Maria P A,Carmen D R,et al.Influence of fruit ripening process on the natural antioxidant content of Hojiblanca virgin olive oil[J].Food Chemistry,2005，89：207-215

[10]李小勇,霍喜东,杨自勇，等.不同方法提取国槐叶黄酮及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2014,35(17):102-106

Li X Y,Huo X D,Yang Z Y,et al.Study on the extraction method and antioxidant activity of flavonoids from Sophora japonica L[J].Science and Technology of Food Industry,2014,35(17):102-106

[11]Xu Z,Feng S L,Shen S A,et al.The antioxidant activities effect of neutral and acidic polysaccharides from Epimedium acuminatum Franch.on Caenorhabditis elegans[J].Carbohydrate Polymers,2016,144： 122-130

[12]Pinar K,Ilhami G,Ahmet C G.Antioxidant activity and polyphenol content of cranberries(Vaccinium macrocarpon)[J].Rec Nat Prod,2015,9(4):496-502

[13]Giuseppina C,Maria S P,Paolo D C,et al.Phenolic compounds in olive oil and olive pomace from Cilento(Campania,Italy)and their antioxidant activity[J].Food Chemistry,2010,121：105-111

[14]李路宁,陈威,赵立仪，等.蓝莓花青素的酰化及其抗氧化性评价[J].食品工业科技,2014,35(6):102-106

Li L N,Chen W,Zhao L Y,et al.Acylation of Blueberry Anthocyanin and its oxidation resistance[J].Science and Technology of Food Industry,2014,35(6):102-106

[15]Espin J C,Soler-Rivas C,Wichers H J.Characterization of the total radical scavenger capacity of vegetable oil and oil fractions using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48： 648-656

[16]Birben E,Sahiner U M,Sackesen C,et al.Oxidative stress and antioxidant defense[J].World Allergy Organization Journal,2012,5(1)： 9-19

[17]Perron N R,Hodges J N,Jenkins M,et al.Predicting how polyphenol antioxidants prevent DNA damage by binding to iron[J].Inorganic Chemistry,2008,47：6153-6161

[18]李楠,师俊玲,王昆.14种海棠果实多酚种类及体外抗氧化活性分析[J].食品科学,2014,35(5):53-58

Li N,Shi J L,Wang K.Composition and in vitro Antioxidant Activity of Polyphenols Extracted from Crabapples[J].Food Science,2014,35(5):53-58.

The Content of Polyphenol and Antioxidant Property of Three Vatieties Virgin Olive Oil

Xiang Chunrong1Xu Zhou1Wang Handong1Liu Jie1Ding Chunbang1Li Tian2Yang Zeshen3
(College of Life Science,Sichuan Agricultural University1,Ya′an 625014)(College of Agronomy,Sichuan Agricultural University2,Chengdu 611130)(Liangshan Zhongze New Tech Development Co.,Ltd.,Xichang3615000)

Three varieties of virgin olive oil were studied in order to determine the content of polyphenol and evaluate the antioxidant properties of polyphenol.Besides,the correlation of total polyphenol content,indivadual polyphenol content and antioxidant property was analyzed via IBM SPSS Statistics 20.These results indicated that total polyphenol contents of three oil were 21.26,23.31 and 26.04 μg/g,respectively,not different significantly among varieties,and the contents of individual polyphenol were little.DPPH radical scavenging activity of Frantoio was the highest.However,hydroxyl radical scavenging activity and Fe2+chelating capability of Arbequina were the highest among varieties.The content of hydroxytyrosol was significantly relative or significantly posistively correlated to DPPH radical scavenging activity,hydroxyl radical scavenging activity and Fe2+chelating capability,and the correlation coefficients were-0.956,0.713 and 0.721,respectively;it was also significantly positively correlated to the content of hydroxybenzoic acid and Fe2+chelating capability.Content of quercitin was significantly negatively correlated to DPPH radical scavenging activity,and significantly positively relative to Fe2+chelating capability.Nevertheless,the contents of total polyphenol,caffeic acid and epicatechin were not highly relative to in vitro antioxidant capacity.These results showed hydroxytyrosol,p-hydroxybenzoic acid and quercetin were the major ingredients of antioxidant.

virgin olive oil,polyphenol,antioxidant properties

TS224;TQ646

A

1003-0174(2017)09-0094-05

四川省科技厅科技支撑计划(2013NZ0047)

2016-06-27

向春蓉，女，1990年出生，硕士，橄榄油品质分析

丁春邦，女，1966年出生，教授，资源植物