MiR-155对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转换的影响及机制研究

张紫微，杨丽霞，吕晋琳，王先梅， 杨智华，陆霓虹

MiR-155对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转换的影响及机制研究

张紫微，杨丽霞，吕晋琳，王先梅， 杨智华，陆霓虹

目的：观察miR-155对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导小鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）表型转换的影响并研究其可能的机制。

方法：原代培养小鼠VSMC，用不同浓度、时间AngⅡ作用于VSMC，然后用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测不同处理组miR-155表达的变化情况。用qRT-PCR检测过表达及抑制表达miR-155后空白对照组、miR-155 mimics组、mimics阴性对照组、miR-155 inhibitors组、 inhibitors 阴性对照组的miR-155水平变化情况，检测转染效率。用免疫蛋白印迹（Western blot）法检测过表达及抑制表达miR-155后空白对照组、AngⅡ组、miR-155 mimics组、AngⅡ+miR-155 mimics组、miR-155 inhibitors组、AngⅡ+miR-155 inhibitors组对AngⅡ激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路的影响。Western blot检测转染miR-155、使用雷帕霉素、细胞外信号调节激酶1/2抑制剂（U0126）后空白对照、AngⅡ组、miR-155 mimics组、AngⅡ+miR-155 mimics组、AngⅡ+ U0126组、AngⅡ+雷帕霉组AngⅡ促进VSMC表型转换的影响，检测两个收缩表型蛋白标志物即平滑肌22α（SM22α）与α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin），及一个合成表型蛋白标志物骨桥蛋白（OPN）。

结果：与作用0 h或0 mol/L AngⅡ相比，AngⅡ作用于VSMC后AngⅡ以浓度、时间依赖方式降低miR-155的表达。转染miR-155后可显著减少基础及AngⅡ促进mTOR与ERK1/2通路激活作用，而转染miR-155 抑制剂可进一步增加基础及AngⅡ促进mTOR与ERK1/2通路激活作用。雷帕霉素、U0126及转染miR-155均可抑制AngⅡ减少收缩表型蛋白标志物SM22α与α-SM-actin的表达，同时抑制AngⅡ促进合成表型蛋白标志物OPN的表达。

结论：AngⅡ通过抑制miR-155表达促进mTOR与ERK1/2激活促进VSMC表型转换。

核糖核酶类；血管紧张素Ⅱ；肌细胞，平滑肌

血管平滑肌细胞（VSMC）作为一种非终末分化细胞，其表型具有可调控性。在不同刺激物作用下，VSMC可从收缩表型向合成表型（去分化表型）转换，最终导致VSMC的增殖、迁移以及分泌活动大大增强[1]。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要活性物质，在体内作用相当广泛，多项研究证实其与AT1受体结合后，可进一步激活下游通路导致VSMC的细胞表型发生改变，从而促进VSMC的增殖、分泌及迁移活性[2,3]。微小 RNA（miRNA）是一类内源性非编码约19～22个核苷酸长度以单链形式存在的小 RNA 分子。miRNA在心血管疾病病理过程中起着十分重要的调控作用[4,5]。近年来，多项研究发现，过表达miR-155可能通过负调控含SH2区域的肌醇5'磷酸酶1（SHIP1）或编码调节磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的调节亚基p85α（PIK3R1）等基因，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路，从而促进肿瘤的进展[6-8]，而Zhu等[9]发现，过表达miR-155可通过作用于靶基因丝裂原活化蛋白激酶3K10 （MAP3K10）抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活，从而抑制动脉粥样斑块的免疫炎症反应。PI3K/AKT与MAPK两大通路均参与AngⅡ对VSMC表型的调控机制，所以我们推测miR-155可能通过调控这两条通路参与AngⅡ对VSMC表型的调控，在此项研究中，我们将以小鼠VSMC为研究对象，观察miR-155是否参与AngⅡ对VSMC表型的调控过程并探索相关机制。

1 材料与方法

实验材料：C57小鼠由昆明医科大学实验动物中心提供，DMEM高糖培养基，胎牛血清，0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶，免疫组化试剂盒，trizol（Invitrogen，美国 ），逆转录试剂盒，PVDF膜，Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国 ），miR-155mimic及miRNA阴性对照（NC），miR-155 inhibitor及NC（上海，吉玛），细胞裂解液，单克隆抗体：SM-22α（Proteintech,美国），α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin，Sigma，美国）, osteopontin（OPN，Proteintech，美国），磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（P-mTOR，CST, #2971，美国），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，Proteintech，美国），磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 （P-ERK1/2，Omega，美国）、细胞外信号调节激酶1/2蛋白（ERK1/2，Omega，美国），二抗IgG-HRP（碧云天公司，江苏，中国）， ECL显色试剂盒。

VSMCS原代培养与传代：无菌条件下取出C57小鼠主动脉，用镊子去除外膜及内膜，磷酸盐缓冲液冲洗3次后将中膜剪成约1 mm3大小的组织块，种植于25 cm2塑料培养瓶，加入含青霉素和链霉素及含10%胎牛血清的高糖细胞培养基3～5 ml，放入37℃恒温箱培养，使组织块浸于培养液中，继续静置培养。培养5～7天可见细胞爬出，呈贴壁生长。将其用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于培养瓶或96孔培养板。选取第3代细胞进行形态学及免疫组化染色方法进行鉴定。第4～8代细胞用于实验。

实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）：Trizol法提取总RNA，取各不同浓度、时间AngⅡ处理的细胞500 ng总RNA为模板，逆转录CDNA， 根 据Hairpin-it RT-PCR miRNA-155定量检测试剂盒（上海，吉玛）操作说明进行逆 转 录 及PCR扩 增。mmu-miR-155（F Primer:5'ACGCTCAGTTAATGCTAATTGTGAT'3；R Primer:5'TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT'3）U6（F Primer:5'ATTGGAACGATACAGAGAAGATT'3;R Primer:5'GGAACGCTTCACGAATTTG'3）。反应结束后确认解离曲线，用软件DataAssistTMv3.0软件（美国应用生物系统公司，美国）以2-ΔΔCt方法来对结果进行分析。

qRT-PCR检测miR-155表达水平的变化：按说明书分别将Lipofectamin 2000与miR-155 mimic及NC，miR-155 inhibitor及NC稀释、混合，室温下孵育20 min，使用qRT-PCR检测转染效率，mimic及inhibitor的最终转染浓度分别为80 nmol/L及50 nmol/L。用qRT-PCR分别检测过表达miR-155（转染miR-155 mimics）与抑制miR-155表达（转染miR-155 inhibitors）后空白对照组、miR-155 mimics组、mimics阴性对照组、miR-155 inhibitors组、inhibitors 阴性对照组的miR-155水平变化情况，检测转染效率。

免疫蛋白印迹（Western blot）法检测蛋白表达：为研究miR-155对mTOR及ERK1/2通路的影响，我们使用Western blot 检测转染miR-155后对基础及AngⅡ作用后的mTOR及ERK1/2的表达情况。此外，为了验证miR-155是否通过影响mTOR及ERK1/2通路抑制AngⅡ促进VSMC表型转换作用，我们使用Western blot检测过表达及抑制表达miR-155后空白对照组、AngⅡ组、miR-155 mimics组、AngⅡ+miR-155 mimics组、miR-155 inhibitors组、AngⅡ+miR-155 inhibitors组3个表型蛋白标志物变化情况。为了观察miR-155对AngⅡ促进VSMCS表型转换的影响，分为空白对照、AngⅡ组、miR-155 mimics组、AngⅡ +miR-155 mimics组、AngⅡ+ U0126组、AngⅡ+雷帕霉组。将各处理组细胞培养基吸出，用预冷磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）洗2次，加入适量胰酶，补充少量培养基终止反应，反复吹打使细胞脱落，转移至灭菌1.5 ml离心管，室温1 500 g离心3 min；弃去上清，预冷PBS洗沉淀1次，室温1 500 g离心3 min；弃去上清，加入适量RIPA裂解液，冰浴30分钟；4℃，9 000 g离心5 min；取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度[10]。于10% SDS-PAGE 行细胞蛋白电泳，湿转法转与聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%的脱脂奶粉PBST缓冲液（PBS+TWeen20）室温封闭过夜，一抗孵育：将一抗以1：500-1:1 000稀释，4℃孵育过夜；第二天将二抗以1：5 000稀释，室温孵育1 h，漂洗，配制ECL显色试剂配制，将膜放于Bio-Rad的化学发光仪器中，滴加适量的ECL发光液后，进行曝光。最后采用Bio-Rad Quantity One软件定量分析。

统计学方法：用SPSS 17.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采取Tukey法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠原代VSMC的鉴定（图1）

倒置相差显微镜下观察原代培养的大鼠 VSMC，细胞呈贴壁生长，形态多为长梭形，细胞质丰富，单层或多层平行排列生长，并呈现典型的峰-谷生长，荧光显微镜下α-SM-actin染色显示胞质染色红色，为阳性染色。

图1 小鼠原代血管平滑肌细胞形态观察及α-平滑肌肌动蛋白疫组化鉴定

2.2 AngⅡ影响VSMC内miR-155的表达（图2）

为研究AngⅡ是否影响VSMC内miR-155的表达，我们将不同浓度（0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）AngⅡ作用于 VSMC 48 h,并将1×10-6mol/L的 AngⅡ作用于VSMC不同时间（0、6、12、24、48 h）后，采用qRT-PCR检测miR-155表达水平的变化。结果显示,与作用0 h或0 mol/L AngⅡ相比，AngⅡ作用于VSMC后，呈浓度、时间依赖方式降低miR-155表达水平。

图2 血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞miR-155表达水平的影响

2.3 miR-155转染表达检测（图3）

与空白对照组和阴性对照组比较，转染miR-155 mimics后显著增加miR-155表达水平，而转染miR-155 inhibitors后则显著降低miR-155表达水平。

图3 qRT-PCR检测不同处理组中小鼠VSMC的miR-155表达水平

2.4 miR-155抑制雷帕霉素靶蛋白及细胞外信号调节激酶1/2通路（图4）

图4 蛋白免疫印迹法检测不同处理组中血管平滑肌细胞P-mTOR、mTOR、P-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达

与空白对照组相比，1×10-6mol/L AngⅡ作用于VSMC 48 h后可显著增加mTOR及ERK1/2磷酸化水平，激活mTOR及ERK1/2通路，而转染miR-155 mimics后显著减少基础mTOR及ERK1/2磷酸化水平并可减弱AngⅡ促进mTOR及ERK1/2通路的激活作用，与之相对应的是，转染miR-155 inhibitors后则可显著增加基础mTOR及ERK1/2磷酸化水平并进一步增强AngⅡ促进mTOR及ERK1/2通路的激活作用。

2.5 miR-155 mimics,雷帕霉素及U0126均抑制AngⅡ促进VSMC表型转换作用（图5）

与空白对照组相比，1×10-6mol/L AngⅡ作用于VSMC 48 h后可促进细胞处于去分化状态，显著减少收缩表型蛋白标志物SM22α和α-SM-actin蛋白的表达，而增加合成表型蛋白标志物骨桥蛋白（OPN）的表达。转染miR-155 mimics可增加基础SM22α和α-SM-actin蛋白的表达水平，减少基础OPN蛋白表达水平，并可减弱AngⅡ削减SM22α和α-SM-actin蛋白及增加OPN蛋白表达的作用。1×10-6mol/L AngⅡ分别联合应用mTOR通路抑制剂Rapamycin（10 ng/ml）及ERK1/2通路抑制剂U0126（10 μM）后均可显著抑制AngⅡ这种促血管平滑肌细胞表型转换的作用。

图5 蛋白免疫印迹法检测不同处理组血管平滑肌细胞中SM22α、α-SM-actin、OPN的表达

3 讨论

目前已有多项研究显示有多种miRNA参与VSMC的表型调控[11-13]。AngⅡ作为一种常见的体内刺激因子，可调节VSMC表型从安静的分化状态转换为易于发生增殖、迁移、分泌的去分化状态，参与各种心血管疾病的发生、发展[14]。本研究试图寻找一种关于AngⅡ促进VSMC表型转换的新机制。通过不同浓度、时间的AngⅡ作用于VSMC，观察miR-155表达的变化，结果显示AngⅡ以浓度、时间依赖方式抑制miR-155的表达，这提示我们miR-155可能作为AngⅡ促进VSMC表型转换的中间桥梁发挥其作用。AngⅡ可激活PI3K/AKT与MAPK通路参与细胞表型的调控[15,16]，而新近研究证实miR-155可通过作用不同靶基因调控这两条通路[6,9]，所以我们推测miR-155可能参与到AngⅡ促VSMCs表型转换过程。

本研究发现过表达miR-155后可显著抑制基础水平及AngⅡ促进mTOR与ERK1/2蛋白的活化，而抑制miR-155表达则可进一步促进mTOR及ERK1/2蛋白的活化，证实miR-155可抑制PI3K/AKT/mTOR与MAPK/ERK1/2通路的激活。Western blot结果显示AngⅡ可显著抑制收缩表型蛋白标志物SM22α和α-SM-actin的表达，促进合成表型蛋白标志物OPN的表达，使用mTOR通路抑制剂雷帕霉素及ERK1/2通路抑制剂U0126可显著抑制AngⅡ促VSMC表型转换的作用。与使用雷帕霉素及U0126的结果相一致，转染miR-155 mimics也可取得这种抑制AngⅡ促VSMCs表型转换的效果，证实miR-155可通过抑制PI3K/AKT与MAPK的激活参与AngⅡ促VSMC表型转换的调控。这与之前的报道不尽一致，如在B细胞淋巴瘤中miR-155可通过下调 PIK3R1，一种PI3K/AKT通路的负调控因子，从而激活PI3K/AKT通路促进肿瘤的进展[6]。这种现象可能跟不同的细胞、不同的刺激物下miR-155作用于不同靶基因直接或间接发挥相应作用有关，本研究miR-155具体通过调控哪些靶基因发挥其调控细胞表型作用还有待下一步研究证实，这也提示我们miRNA转化体内研究的复杂性。

总之，本研究证实了AngII通过抑制miR-155表达促进VSMC表型转换，AngⅡ可以浓度、时间依赖方式降低miR-155表达水平，而转染miR-155 mimics后可抑制AngⅡ作为mTOR与ERK1/2激活剂所起到的促VSMC去分化作用，从而减少AngⅡ对VSMC的促增殖、迁移及分泌作用，为心血管疾病提供新的治疗方向。

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Effect of miR-155 on AngII-induced Mice Vascular Smooth Muscle Cell Phenotype Switching With its Mechanism

ZHANG Zi-wei, YANG Li-xia, LV Jin-lin, WANG Xian-mei, YANG Zhi-hua, LU Ni-hong.
Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area, Kunming (650032), Yunnan, China
Corresponding Author: YANG Li-xia, Email: doctorlxyang@126.com

Objective: To observe the effect of miR-155 on angiotensin II (AngII)-induced mice vascular smooth muscle cell(VSMC) phenotype switching with its possible mechanism.

Methods: Primary cultured mice VSMCs were treated by AngII at different concentrations and time periods, relevant expressions of miR-155 were examined by RT-PCR. qRT-PCR was conducted to determine miR-155 changes in Blank control group, miR-155 mimics group, miR-155 mimics negative control (NC) group, miR-155 inhibitor group and miR-155 inhibitor NC group. Western blot analysis was performed to measure the effect of miR-155 on AngII-enforced ERK1/2 and mTOR signaling pathway in Blank control group, AngII group, miR-155 mimics group, AngII+miR-155 mimics group, miR-155 inhibitor group and AngII+miR-155 inhibitor group; to detect the impact of miR-155, rapamycin (Rap) and U0126 onAngII promoted VSMC phenotype switching in Blank control group, AngII group, miR-155 mimics group, AngII+miR-155 mimics group, AngII+U0126 group and AngII+Rap group, and to detect protein expressions of SM22α, α-SM-actin (contractile phenotype marker protein) and OPN (synthetic phenotype marker).

Results: AngII decreasing miR-155 expression was in a dose- and time-dependent manner. miR-155 could reduce the basal and AngII-promoted ERK1/2, mTOR signaling pathway, while miR-155 inhibitor could elevate the above effect. Rap,U0126 and miR-155 could inhibit AngII-attenuated expressions of SM22α, α-SM-actin and meanwhile inhibit AngII-enforced expression of OPN.

Conclusion: miR-155 could inhibit mice AngII-promoted VSMC phenotype switching which might be via inhibiting the activations of mTOR and ERK1/2.

RNA; Angiotensin II; Muscle cells, smooth muscle

国家自然科学基金面上项目（81170250）

650032 云南省昆明市，成都军区昆明总医院 心内科（张紫微、杨丽霞、王先梅、杨智华）；昆明医科大学昆明总医院临床学院（吕晋琳、陆霓虹）

张紫微 主治医师 博士研究生 主要从事心血管病医学研究 Email: zzwkunming@126.com 通讯作者：杨丽霞 Email:doctorlxyang@126.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1019-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.019

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1019.)

2016-08-27）

（编辑：许菁）