组织蛋白酶S对小鼠主动脉环微管腔形成的影响

白莉艳，类延娜，成宪武，李香

基础与实验研究

组织蛋白酶S对小鼠主动脉环微管腔形成的影响

白莉艳，类延娜，成宪武，李香

目的：探讨组织蛋白酶S (CatS)对小鼠主动脉环微管腔形成的影响。

方法：分别在C57BL6野生型雄性小鼠（CatS+/+组）和CatS基因敲除雄性小鼠（CatS-/-组）建立下肢缺血模型，每组8只，分别测定术前、术后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流进行比较分析。再将CatS+/+组小鼠，分为正常对照亚组、选择性CatS抑制剂（LHVS）亚组、非选择性CatS抑制剂（E64d）亚组和基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂（GM6001）亚组，每组2只，观察小鼠主动脉环微管腔形成情况。用免疫荧光法异硫氰酸荧光素（FITC）-CD31标记微管腔形成情况。

结果：（1）CatS-/-组小鼠明显抑制下肢血流的恢复。用激光多普勒超声血流仪检测下肢血流，缺血与非缺血下肢血流比值统计结果显示：CatS-/-组小鼠术后第7、14、21天缺血下肢血流恢复均明显慢于CatS+/+组（P均＜0.05）。（2）CatS-/-组小鼠的主动脉环中生长出来的微管腔与CatS+/+组小鼠比较明显减少，两者有统计学差异（P＜0.001）。（3）LHVS、E64d以及GM6001亚组分别与正常对照亚组比较，均明显抑制主动脉环微管腔的形成，两者差异均有统计学意义（P均＜0.05）。（4）主动脉环培养形成的微管腔由内皮细胞组成。

结论：CatS在缺血性血管再生中发挥有益的作用，不但增加了主动脉环微管腔形成的数量，并且促进了缺血下肢的血流恢复。这些结果为寻找下肢缺血性血管再生提供了理论依据。

组织蛋白酶类；微管腔；血管再生

下肢动脉硬化性疾病（LEAD）其发病率呈现出逐年升高的趋势。国外研究显示,LEAD 患者伴有持续性疼痛者占28%，需要血管重建或截肢手术者占8.2%。更触目惊心的临床研究报道，LEAD严重肢体缺血患者1年病死率约25%，截肢率高达45%[1]。2002年，血管内介入治疗问世后，给LEAD的临床治疗带来希望，但是，术后早中期25%～45%支架内再狭窄等，束缚了LEAD介入治疗的广泛临床应用[2]。被誉为分子搭桥术的血管再生医学引起全世界医学专家的注目。然而，缺血后血管再生及细胞治疗的分子机制尚不明确。因此，寻找下肢缺血性血管再生的治疗靶点、明确其作用机制、开发有效安全的治疗措施成为各国医学专家共同的任务和亟需解决的难题。本研究旨在观察组织蛋白酶S （CatS）对小鼠主动脉环微管腔形成的影响，为寻找下肢缺血性血管再生的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

动物来源及分组：8周龄C57BL6野生型雄性小鼠（CatS+/+组）和8周龄CatS基因敲除雄性小鼠（CatS-/-组）由日本名古屋大学动物实验室提供，体重为21～25 g。第一组实验：分别在CatS+/+和CatS-/-两组小鼠建立下肢缺血模型，每组8只。分别测定术前、术后即刻、1天、4天、7天、14天、21天血流进行比较分析。第二组实验：再将CatS+/+组小鼠，分为正常对照亚组、选择性CatS抑制剂（LHVS）亚组、非选择性CatS抑制剂（E64d）亚组和基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂（GM6001）亚组，每组2只，观察小鼠主动脉环微管腔形成情况。用免疫荧光法异硫氰酸荧光素（FITC）-CD31标记微管腔形成情况。

1.2 实验方法

下肢缺血模型的建立：首先分离股神经后结扎股动脉根部，剥离股动脉三个主要分支并结扎，然后切除股动脉主干及其分支，建立下肢缺血模型。激光多普勒血流仪测定下肢血流：采用Laser Doppler Perfusion Imager （Lisca AB 公司）的激光多普勒血流仪，测量术前与术后不同时间点的缺血侧（左侧下肢）和对侧非缺血侧（右侧下肢）的血流灌注情况。每次测量之前，给予小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）进行麻醉，麻醉后采取仰卧位，置于37℃条件下15 min。仰卧位扫描之后，存储图像，图像存储形式为整个双下肢区域的二维图像，经过PIMⅡPatch Test WIZARD软件分析，血流灌注情况表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一时间点的缺血侧与非缺血侧的血流灌注情况的比值表示其缺血下肢血流恢复情况。

1.3 小鼠主动脉环血管新生实验步骤

取材：心脏采血处死小鼠，体式显微镜下钝性分离小鼠胸主动脉，使用显微剪和眼科镊小心剔除血管周围脂肪及结缔组织。将分离的主动脉转移至预冷的无血清培养基中[3]。消化：取下胸主动脉后，将其置于预先复温的Ⅱ型胶原酶（ 2 g/L） 中，放入37℃ 培养箱消化6～7 min，主动脉内插入球囊，将内皮细胞层朝外。饥饿：尽可能将血管均匀地剪成约1 mm长的动脉环。取出动脉环放入无血清培养基中，在37℃，5%CO2培养箱中饥饿过夜。Ⅰ型胶原包埋主动脉环：预冷的无血清培养基稀释胶原至终浓度为 1 g/L，使用 NaOH（ 200 g/L） 调整 pH 至 7.4。Ⅰ型胶原以约200 µl/孔包被预冷的24 孔板，将动脉环包埋入液态基质胶。24孔板在室温平衡10 min后放入37℃培养箱，孵育30 min，待胶原凝固后，正常对照亚组和LHVS亚组、E64d亚组和GM6001亚组，均加入DMEM +血管内皮生长因子（ VEGF，50 ng /ml） 100 µl /孔覆盖胶原表面，隔天换液，培养7天。其中，LHVS浓度为5 nmol/L，E64d浓度为 10 μmol/L，GM6001浓度为 20 µmol/L。在倒置显微镜下观察主动脉环微管腔出芽面积（×200倍放大）。出芽面积用定量分析区域内血管每个图像的像素所占的百分比表示。

1.4 主动脉环试验

用分子遗传学观察血管生成的新方法，观察内皮细胞组成的微血管网络。CatS+/+小鼠反转后的主动脉环，置于预先包被有Collagen type l胶原的6 cm的培养皿中，给予VEGF（最终浓度为50 ng/ml）+内皮基础培养基-2（EBM-2）中培养7天。然后用免疫荧光法FITC-CD31标记微血管出芽情况。将1：100配成的FITC mouse anti-humenCD31置入后，37℃ 培养 90 min，0.01 M PBS（0.2 M Na2HPO411.5 g, NaH2PO4·2H2O 2.2 g, NaCl 80 g 溶于 1 000 ml水，pH=7.4）清洗3次，多聚甲醛溶液（4%PFA）主要由多聚甲醛、磷酸盐、去离子水组成，pH=7.4，室温浸泡10 min后， PBS清洗3次，玻片上涂4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI），将动脉环封片后荧光显微镜观察[4]。

1.5 统计学处理

统计学分析应用SPSS15.0分析系统，计量数据以均数±标准误（±sE）表示，用student的非配对T检验或Tukey post hoc test 双因素多重统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CatS+/+ 和CatS-/- 两组小鼠缺血与非缺血下肢血流的动态变化（图1）。

CatS-/-组小鼠明显抑制下肢血流的恢复。观察到术后即刻、术后1天血流明显下降,术后第4天开始血流逐渐恢复，术后第7、14、21天CatS-/-组小鼠缺血下肢血流恢复均明显慢于CatS+/+组（P均＜0.05）。

图1 CatS+/+和CatS-/-两组小鼠缺血与非缺血下肢血流的动态变化（n=8）

2.2 CatS+/+和CatS-/-两组小鼠主动脉环微管腔形成（图2）

CatS-/-组小鼠的主动脉环中生长出来的微管腔与CatS+/+组小鼠比较明显减少，两者差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.3 利用组织蛋白酶S抑制剂（LHVS，E64d）及MMP抑制剂（GM6001）观察小鼠

主动脉环微管腔形成情况（图3）。LHVS、E64d亚组以及GM6001亚组分别与正常对照亚组比较，明显抑制主动脉环微管腔的形成，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图2 CatS+/+和CatS-/-两组小鼠主动脉环微管腔形成（n=4，×200）

图3 各亚组小鼠主动脉环微管腔形成情况（n=2，×200）

2.4 小鼠主动脉环的免疫荧光鉴定（图4）。

倒置显微镜下观察，绿色荧光为内皮细胞由FITC- CD31特异性标记，蓝色荧光为DAPI染色的细胞核。在免疫组化中，CD31是主要用于证明内皮细胞的存在。结果表明：主动脉环培养以后形成的微管腔由内皮细胞组成

图4 小鼠主动脉环的免疫荧光鉴定（×200）

3 讨论

2004年，Cheng等[5，6]报道了CatS 在损伤性增生内膜及心力衰竭心肌中表达明显增高，并在心血管重构中起着重要作用。此后，也发现CatS主要在血管平滑肌细胞膜外与ανβ3 整合素结合，调控平滑肌细胞的移动及浸润功能[7]。药物干预CatS可以抑制动脉斑块形成及改善斑块稳定性[8]。这些研究结果提示，CatS参与动脉粥样斑块形成、发展、破裂和破裂后修复的全过程。以往的散在报道显示：CatS一方面通过降解、失活成纤维细胞生长因子（BFGF）或分解4型胶原蛋白产生具有抗血管再生活性的血管抑制素，另一方面通过修饰以及释放血管生长调节因子控制肿瘤血管新生[9]。2010年岛田等日本学者利用基因敲除或药物干预方法验证骨髓来源内皮祖细胞-组织蛋白酶L 在角膜和脉络膜血管再生过程中作用[10]。Urbich 等[11]研究发现在内皮祖细胞中组织蛋白酶L高水平表达，并促使骨髓内皮祖细胞归巢于缺血血管床中发挥了重要作用。以上研究结果揭示：CatS在动脉粥样硬化性血管疾病的发生、发展中发挥着重要的作用[12]，亦可能参与血管内皮细胞和内皮祖细胞的功能调控。下肢缺血性疾病最主要的病因为动脉粥样硬化，因此，CatS可以成为参与缺血性血管再生的关键成员。

本研究结果表明：（1）CatS-/-组小鼠下肢血流的恢复明显受到抑制。用激光多普勒超声血流仪检测下肢血流，缺血与非缺血下肢血流比值统计结果显示：CatS-/-组小鼠术后第7、14、21天缺血下肢血流恢复均明显慢于CatS+/+组（P均＜0.05）。（2）CatS-/-小鼠的主动脉环中生长出来的微管腔与CatS+/+小鼠比较明显减少，两者差异有统计学意义（P＜0.001）。（3）LHVS亚组、E64d亚组以及GM6001亚组分别与正常对照亚组比较，均明显抑制主动脉环微管腔的形成，差异有统计学意义（P均＜0.05）。（4）主动脉环培养形成的微管腔由内皮细胞组成。目前较多的研究集中于CatS在动脉硬化性心血管疾病中的表达及其作用，而CatS在缺血性血管生成中表达及其作用尚少见报道[13]。本研究提示：CatS在缺血性血管再生中发挥有益的作用，不但增加了主动脉环微管腔形成的数量，并且促进了缺血下肢的血流恢复。这些结果为寻找下肢缺血性血管再生提供了理论依据。

[1]Kazmers A, Perkins AJ, Jacobs LA. Major lower extremity amputation in VeteransAffairs medical centers. Ann Vasc Surg, 2000, 14: 216-222.

[2]Vogel TR, Dombrovskiy VY, Galinanes EL, et al. Preoperative statins and limbsalvage after lower extremity revascularization in the Medicare population. Circ CardiovascInterv, 2013, 6: 694-700.

[3]李宁, 王雄. 利拉鲁肽对离体大鼠胸主动脉环的血管舒张效应及其机制研究.中国循环杂志, 2015, 30: 50-53.

[4]Cheng XW, Kuzuya M, Kim W, et al. Exercise training stimulates ischemia-induced neovascularization via phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent hypoxia-induced factor -1 alpha reactivation in mice of advanced age. Circulation, 2010, 122: 707-716.

[5]Cheng XW, Obata K, Kuzuya M, et al.Elastolyticcathepsin induction/activation system exists in myocardium and is upregulated inhypertensive heart failure. Hypertension, 2006, 48: 979-987.

[6]Cheng XW, Huang Z, Kuzuya M, et al. Cysteine protease cathepsins in atherosclerosis-based vascular disease and its complications.Hypertension, 2011, 58: 978-986.

[7]Cheng XW, Kuzuya M, Nakamura K, et al. Localization of cysteine protease, cathepsin S, to thesurface of vascular smooth muscle cells by association with integrin alphanubeta3. Am J Pathol, 2006, 168: 685-694.

[8]Sasaki T, Kuzuya M, Nakamura K, et al. AT1 blockade attenuates atherosclerotic plaque destabilizationaccompanied by the suppression of cathepsin S activity in apoE-deficient mice. Atherosclerosis, 2010,210: 430-437.

[9]Wang B, Sun J, Kitamoto S, et al. Cathepsin S controls angiogenesis and tumor growth via matrix-derived angiogenic factors. J Biol Chem,2006, 281: 6020-6029.

[10]Shimada N, Ohno-Matsui K, Iseki S, et al. Cathepsin L in bone marrow-derived cells is required forretinal and choroidal neovascularization. Am J Pathol, 2010, 176: 2571-2580.

[11]Urbich C, Heeschen C, Aicher A, et al. Cathepsin L is required for endothelial progenitor cell-inducedneovascularization. Nat Med, 2005,11: 206-213.

[12]秦彦文，唐朝枢. 腹主动脉瘤发病的新祸首—溶酶体组织蛋白酶.中国循环杂志, 2012, 27: 324-326.

[13]Li X, Cheng XW , Hu L, et al. Cathepsin S activity controls ischemiainduced neovascularization in mice，Int J Cardiol, 2015, 183: 198-208.

Impact of Cathepsins S on Aortic Ring-derived Micro Vascular Cavity Formation in Experimental Mice

BAI Li-yan, LEI Yan-na, CHENG Xian-wu, LI Xiang.
Department of Cardiology, Yanbian University Affiliated Hospital, Yanji (133000), Jilin, China
Corresponding Author: LI Xiang, Email:15526770377@163.com

Objective: To investigate the impact of cathepsins S (CatS) on aortic ring-derived micro vascular cavity formation in experimental mice.

Methods: Hindlimb ischemia model was established in CatS+/+and CatS-/-mice,n=8 in each group. The blood fl ow in hindlimb was measured before is chemic surgery; immediately and 1, 4, 7, 14, 21 days after surgery. CatS+/+mice were further divided into 4 subgroups: Normal control subgroup, Selective CatS inhibitor (LHVS) subgroup, Non-selective CatS inhibitor(E64d) subgroup and MMP inhibitor (GM6001) subgroup;n=2 in each subgroup. The mice aortic ring-derived micro vascular cavity formation was observed by FITC-CD31 immunof l uorescence method.

Results:①CatS-/-mice had inhibited blood fl ow recovery after is chemic surgery. Laser Doppler blood fl ow (LDBF)examination indicated that compared with CatS+/+group, CatS-/-group had slower hindlimb blood flow recovery,P＜0.05;②CatS-/-group had the less aortic ring-derived micro vascular cavities,P＜0.001.③Compared with Normal control subgroup,LHVS subgroup, E64d subgroup and GM6001 subgroup had suppressed micro vascular cavity formation, allP＜0.05.④Aortic ring-derived micro vascular cavity was composed by endothelial cells.

Conclusion: CatS plays a beneficial role in is chemic vascular regeneration in experimental mice; it is not only increasing aortic ring-derived micro vascular cavity formation, but also promoting blood flow recovery in is chemic hindlimb. Our finding provides a theoretical basis for new therapeutic target in is chemic vascular regeneration.

Cathepsins; Micro vascular cavity; Vascular regeneration

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1015.)

国家自然科学基金资助项目（81660240）

133000 吉林省延吉市，延边大学附属医院 心血管内科（白莉艳、成宪武、李香），重症监护病房（类延娜）

白莉艳 住院医师 硕士研究生 主要从事组织蛋白酶与心血管疾病发病机制的研究 Email: zhongtian200330@163.com 通讯作者：李香Email:15526770377@163.com

R54

A

1000-3614（2017）10-1015-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.10.018

2016-11-01）

（编辑：王宝茹）