基于衍生化技术的游离脂肪酸的色谱-质谱分析方法研究进展

刘 明，魏 芳，谢 亚，董绪燕，陈 洪，黄凤洪

(中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料加工重点实验室，农业部油料作物生物学与遗传育种重点实室，油料油脂加工技术国家地方联合工程实验室，油料脂质化学与营养湖北省重点实验室，湖北 武汉 430062)

综 述

基于衍生化技术的游离脂肪酸的色谱-质谱分析方法研究进展

刘 明，魏 芳*，谢 亚，董绪燕，陈 洪，黄凤洪

(中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料加工重点实验室，农业部油料作物生物学与遗传育种重点实室，油料油脂加工技术国家地方联合工程实验室，油料脂质化学与营养湖北省重点实验室，湖北 武汉 430062)

游离脂肪酸在生物体内含量极低，由于结构中缺少易电离的官能团，导致质谱分析时检测灵敏度不高。利用化学衍生化技术对其进行结构修饰是改善色谱行为和提高质谱响应的有效手段。近年来，化学衍生化结合色谱和质谱技术在游离脂肪酸检测中得到广泛应用。该文综述了国内外基于衍生化技术的游离脂肪酸分析方法及其应用研究进展。

游离脂肪酸；化学衍生化；色谱；质谱；研究进展

脂肪酸是一类羧酸化合物，由碳氢组成的烃类基团连接羧基构成。脂肪酸通常以酯化形式存在，作为中性脂、磷脂和糖脂等脂质的组分(又称为脂肪酸酯或总脂肪酸)。酯化脂肪酸在磷脂酶的作用下水解得到游离脂肪酸(Free fatty acids，FFA)，游离脂肪酸为非酯化的脂肪酸，是类脂代谢物的重要组成部分。一方面，外源性的脂肪通过血浆转运，以游离脂肪酸的形式进入脂肪细胞，再合成脂肪储存，同时机体内的内源性脂肪主要在肝脏中合成，也通过血浆转运而进入脂肪细胞储存；另一方面，储存的脂肪不断降解，以游离脂肪酸的形式进入各组织被氧化利用，使脂肪代谢处于动态平衡。研究表明，游离脂肪酸与糖、脂代谢异常及其他心血管病，如肥胖、高血压、高胰岛素血症、2型糖尿病等密切相关[1-3]。

此外，食用油中的游离脂肪酸主要是甘油三酯的水解产物；游离脂肪酸不稳定，易导致油脂的氧化和酸败，影响油的品质和功能。在粗制油中游离脂肪酸组成可用于描述压榨油的质量和评估油损伤程度。游离脂肪酸成分可以作为油品在不同水分、温度、含氧量、光照贮藏以及煎炒过程中的降解参数。

游离脂肪酸的传统检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[4-5]和液相色谱-质谱法(LC-MS)[6-7]，游离脂肪酸在生物体内及油品中含量极低，且结构中缺少易电离的官能团，导致质谱分析灵敏度不高。利用化学衍生化技术对其进行结构修饰是改善色谱行为和提高质谱响应的有效手段。近年来，化学衍生化结合色谱和质谱技术在游离脂肪酸检测中得到广泛应用。本文综述了目前国内外基于化学衍生化结合气相色谱-质谱和液相色谱-质谱技术的游离脂肪酸分析方法及其应用研究进展。

1 化学衍生化技术概述

化学衍生化技术[8-9](Chemical derivatization)是一种将待测化合物与具有特定基团的衍生化试剂通过定量快速反应生成符合要求的衍生化产物，然后通过检测衍生化产物的量来间接测定待测物含量的方法。经化学衍生化后能够改变待测物的检测特性，增加其对检测器的响应，并且能够生成稳定的衍生化产物以改善待测物的不稳定性。衍生化技术可提高电离效率，减少复杂样品分析时的电离抑制，进而提高电喷雾质谱分析的检测灵敏度和选择性。衍生化技术适用于实际样品中带有目标官能团的代谢物的准确定量和相对定量分析。在选择衍生试剂时需综合考虑以下因素[8-10]：衍生试剂必须包含反应功能团；衍生试剂必须稳定；衍生试剂本身和生成的副产物干扰小；衍生化反应条件温和；如有可能，试剂应无毒；衍生步骤应适于自动化。国内外已有许多文献利用衍生化技术对脂肪酸进行结构修饰，将其转化为易于检测的新结构，从而提高检测灵敏度。

此外，质谱分析脂肪酸及其代谢物时，还存在复杂代谢物稳定同位素内标获得十分困难等问题。为解决以上问题，稳定同位素标记衍生化技术(Stable isotope-coded derivatization，ICD)被开发出来。稳定同位素衍生化定量方法的原理是使用化学衍生的办法为含某一特定官能团的化合物引入同位素标签，轻/重标记的样品等量混合后进行质谱分析，同种物质会因质量上的差异在质谱图中出现1对同位素特征峰。由于它们的离子化效率相同，可通过比较轻/重同位素标记的同一物质谱峰强度，来分析不同处理样品中该分析物的含量变化。通过稳定同位素标记衍生化技术[11-14]，将脂肪酸代谢物引入不同的同位素标记基团，其中1个同位素标记衍生物作为内标，有利于减小基质效应，实现定量分析。

在气相色谱-质谱分析中，利用氢轻重标记甲醇(d0/d3)甲酯化脂肪酸[15-18]，d0-甲醇标记脂肪酸标准品，d3标记样品中脂肪酸，以d0-甲醇标记的脂肪酸甲酯作为内标，两者等体积混合，然后采用气相色谱-质谱进行定量分析。Chen等[18]应用d0/d3-甲醇对脂肪酸进行甲酯化标记，结合GC-MS对健康小鼠肝脏和肝损伤小鼠肝脏中的脂肪酸进行定性和相对定量分析，比较健康和患病小鼠肝脏中脂肪酸的变化，寻找肝损伤小鼠肝脏中的脂肪酸生物标记物。在液相色谱-质谱分析中，Lamos等[19-20]选择氢轻重标记的乙酰胺对鸡蛋中的脂肪酸进行衍生化，形成脂肪酸季胺衍生物，由于分析物引入1个带正电荷的季胺基团，使其能够在ESI-MS正离子模式下分析，并且提高了检测灵敏度，结合HPLC-MS法对圈养和散养鸡蛋中的脂肪酸变化进行了定量分析。

2 气相色谱法及气相色谱-质谱联用法

气相色谱(GC)是目前应用最广泛的检测脂肪酸的方法，由于脂肪酸含有羧基等极性基团，不易挥发，因此需先将其甲酯化为易挥发的非极性脂肪酸甲酯，以便于气相色谱分析。甲酯化是用于脂肪酸衍生化的经典方法，其衍生化试剂采用氢氧化钠-甲醇溶液、浓硫酸-甲醇溶液、氯甲酸甲酯、三氟化硼(BF3)-甲醇溶液等，总脂肪酸的酯化反应多用氢氧化钠-甲醇甲酯化[21-23]，而游离脂肪酸的酯化反应多采用浓硫酸-甲醇甲酯化。常用的衍生化技术除甲酯化外，还有硅烷化、胺化和酰化等。

Cha等[24]采用固相微萃取(Solid phase micro-extraction,SPME)对肺结核病人唾液中的游离脂肪酸(FFA)进行萃取富集，而后采用6%浓硫酸-甲醇对FFA萃取液进行甲酯化衍生反应(于80 ℃下加热反应15 min)，然后采用气相色谱-质谱(GC-MS)对FFA进行分析。本实验室应用磁性纳米颗粒固相萃取(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)技术对食用油中FFAs进行萃取富集，在解吸附过程中加入2 mL 1%浓硫酸-甲醇，涡旋5 min，能够同时实现FFAs的解吸附和甲酯化衍生反应，结合GC/FID分析，成功应用于植物油中FFAs的检测[25]。Gao等[26]采用氯甲酸甲酯在4-二甲基氨基吡啶的催化作用下，使游离脂肪酸与氯甲酸甲酯发生酯化反应，然后结合GC/FID检测人血清和血浆中FFAs。

Notter等[27]采用三甲基硅烷化反应作为衍生化方法测定圈养猪脂蜡体中的游离脂肪酸含量，首先采用固相萃取(氨基柱)纯化富集游离脂肪酸，然后向FFA萃取物中加入三甲基硅烷，60 ℃加热30 min，得到硅烷化产物，采用GC-MS分析，检测到猪脂蜡体中有8种游离脂肪酸。

Kangani等[28]利用胺化反应对血浆中游离脂肪酸进行衍生化，采用二甲胺及双-(2-甲氧基乙基)胺三氟化硫作为衍生化试剂将游离脂肪酸衍生成脂肪酸的二甲酰胺形式。该衍生化方法温和、有效，且对FFAs具有专属选择性，所以无需将FFAs从总脂中先富集和纯化出来，其灵敏度高，重复性好，具有应用参考价值。表1列出了文献中已报道的不同衍生化技术结合气相色谱法分析游离脂肪酸的研究及其应用。

表1 不同衍生化技术结合气相色谱法在游离脂肪酸分析中的应用Table 1 Applications of different derivatization methods couple with GC for the analysis of free fatty acids

3 液相色谱及液相色谱-质谱联用法

液相色谱(LC)用于游离脂肪酸分离需在流动相中添加甲酸等有机酸，以使分析物能够保留在反相色谱柱中，保证色谱分离；但由于电喷雾液滴中弱酸能够携带很多负电荷，抑制分析物羧酸负离子的形成，从而抑制分析物的离子化效率，不利于分析物的质谱检测[38]。因此，将羧酸化合物通过化学衍生化反应转化为阳离子化合物，在质谱正离子检测模式下进行分析，可以避免酸性流动相的离子抑制，提高电离效率，从而能够提高电喷雾电离质谱(ESI-MS)的检测灵敏度。

在基于化学衍生化技术结合液相色谱-质谱联用法(LC-MS)的游离脂肪酸分析中，游离脂肪酸与衍生化试剂主要发生酯化反应和酰胺化反应，形成的衍生产物主要有脂肪酸季胺类衍生物、叔胺类衍生物、哌嗪-嘧啶衍生物、苯并呋咱类衍生物以及其他衍生物。

3.1 脂肪酸季胺类衍生物

图1 衍生试剂BMP和CMP与脂肪酸的反应[38]Fig.1 Derivative reaction of BMP and CMP with fatty acids[38]

Regnier等[38]采用2-溴-1-甲基吡啶碘化物(2-Bromo-1-methylpyridinium iodide,BMP)和3-甲醇-1-甲基吡啶碘化物(3-Carbinol-1-methylpyridinium iodide,CMP)衍生游离脂肪酸，CMP的羟基与脂肪酸的羧基发生酯化反应生成3-酰氧甲基-1-甲基吡啶碘化物(3-Acyl-oxymethyl-1-methylpyridinium iodide,AMMP)衍生物(图1)，其中催化试剂三乙胺(TEA)提供弱碱性环境，促进衍生化反应的进行。该衍生化技术结合HPLC-MS/MS 联用技术被用于人血清中的游离脂肪酸(C4～C24)的分析，与在负离子模式下检测未衍生的游离脂肪酸相比，其灵敏度提高了约2 500倍。

图2 衍生试剂AMPP与脂肪酸的反应[39]Fig.2 Derivative reaction of AMPP with fatty acids[39]

Bollinger等[19,39-43]合成了一种新的衍生化试剂4-氨甲基苯基吡啶((4-Aminomethylphenyl) pyridinium,AMPP)用于衍生游离脂肪酸，在AMPP吡啶N—C键之间引入1个带正电荷的苯环标记基团，以增强吡啶N—C之间的稳定性，同时可以增强衍生产物与反相色谱柱之间的作用，从而减少ESI-MS/MS分析的基质效应。该衍生化技术结合LC-MS方法，可应用于生物样品中脂肪酸氧化物和游离脂肪酸的分析。AMPP与游离脂肪酸的衍生化反应中，以N,N-二甲基酰胺(DMF)为溶剂，在酰胺合成中，碳二亚胺(EDC)作螯合剂，与羧基活化剂N-羟基苯并三氮唑(HOBt)联用，用于—COOH与—NH2的缩合反应，HOBt的—OH在EDC的作用下与羧酸生成酯，再被AMPP的—NH2亲核攻击取代，形成1个稳定的带正电头部基团的季胺化合物(图 2)。经AMPP衍生后，游离脂肪酸的羧基转变为1个带正电的季胺基的化合物，结合HPLC-ESI-MS/MS联用技术分析，游离脂肪酸的灵敏度较ESI负离子模式下提高了约60 000倍。此外，AMPP衍生物在质谱中的碰撞诱导解离是从远离正电荷标签部分开始产生碎片，即远电荷碎裂规律，因此AMPP衍生产物能够产生特异性的质谱碎片，有助于游离脂肪酸双键位置异构体的结构鉴定。

Johnson[44-45]采用二甲基乙醇胺(Dimethylaminoethanol,DMAE)和碘甲烷衍生游离脂肪酸，游离脂肪酸首先与DMAE生成二甲基乙醇胺酯化物，然后与碘甲烷反应生成三甲基乙醇胺酯化；Pettinella等[46]将该衍生化技术结合HPLC-MS方法，用于动脉病硬化斑块组织中游离脂肪酸的分析，定性、定量分析了18种游离脂肪酸，其中包括C18∶1的顺反异构体。

这类衍生化技术，通过化学衍生化在游离脂肪酸分子中引入易电离的吡啶基团，可以提高电离效率，减少复杂基质样品的电离抑制，提高分析灵敏度，有利于低丰度游离脂肪酸分子的检测；能够产生丰富的二级碎片离子，利于游离脂肪酸双键位置异构体的结构鉴定。

3.2 脂肪酸叔胺类衍生物

图3 衍生试剂DMED与脂肪酸的反应[48]Fig.3 Derivative reaction of DMED with fatty acids[48]

N,N-二甲基氨基丁二胺(2-Dimethylaminobutylamine,DMBA)[47]和N,N-二甲基乙二胺(2-Dimethylaminoethylamine,DMED)[48-50]能与羧酸化合物反应生成具有叔胺基的衍生物，且衍生产物稳定。Zhu等[48-49]采用1对同位素衍生试剂(DMED,d4-DMED)选择性标记生物样品中类二十烷酸和脂溶性羧酸化合物，在1-氯-4-甲基吡啶碘化物(CMPI)和三乙胺(TEA)的催化作用下，衍生试剂DMED/d4-DMED与羧酸化合物发生酰胺化反应，形成带正电的叔胺化合物(图3)。反应中CMPI为羧基激活剂，TEA为衍生反应提供弱碱性环境，衍生时，CMPI先与脂肪酸发生反应形成中间产物，加入衍生试剂后再与衍生试剂反应形成脂肪酸叔胺衍生物(图3)。在衍生化产物中，引入了1个带正电的叔胺基团，有利于提高分析物的电喷雾电离效率，提高检测灵敏度(提高了9～323倍)。将d4-DMED标记的健康人血清中的脂溶性羧酸(作为内标)与DMED标记的患者血清中的脂溶性羧酸以1∶1混合，实现了溶血性羧酸的相对定量分析。将所建立的方法成功应用于健康人和2型糖尿病患者血清中脂溶性羧酸的剖析及相对定量分析，在患病血清中检测到81种溶血性羧酸存在显著性变化，其中有18种为游离脂肪酸，12种游离脂肪酸含量显著下降，分析其代谢途径，发现在2型糖尿病患者血清中不饱和脂肪酸途径的生物合成代谢异常。

上述叔胺类衍生化技术，反应条件温和，反应时间较长；叔胺基团的引入可以极大地提高电离效率，减少复杂基质的电离抑制，从而获得较高的检测灵敏度；叔胺类衍生化产物在质谱碰撞诱导解离中会产生相同的不带电碎片离子，利用该碎片离子，采用中性丢失扫描模式能够选择性地对同类羧酸化合物进行筛查，极大地提高质谱的选择性。

3.3 脂肪酸苯并呋咱类衍生物

图4 衍生试剂DBD-PZ-NH2与脂肪酸的反应[52]Fig.4 Derivative reaction of DBD-PZ-NH2 with fatty acids[52]

Tsukamoto等[51-53]采用苯并呋咱类(Benzofuroxan)衍生试剂：7-(N,N-二甲基磺酰胺)-4-(胺乙基)哌嗪-2,1,3-苯并呋咱(7-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-4-(aminoethyl) piperazino-2,1,3-benzoxadiazole,DBD-PZ-NH2)及其氘代化合物((d6)-7-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-4-(aminoethyl) piperazino-2,1,3-benzoxadiazole,DBD-PZ-NH2(D))与游离脂肪酸发生化学衍生化反应，生成含有苯并呋咱基团的衍生物(图4)。衍生化反应中，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，碳二亚胺(EDC)为缩合剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)为酰化作用的催化剂，采用DBD-PZ-NH2(D)标记的脂肪酸标准品或对照生物样本中的游离脂肪酸作为内标，与DBD-PZ-NH2标记的生物样本1∶1混合，结合HPLC-MS对大鼠血浆中游离脂肪酸进行了绝对定量分析和相对定量分析。该衍生化技术的优势在于,通过引入稳定同位素标记的衍生试剂可以靶向用于生物样品中含有羧酸类功能基团的复杂化合物的绝对定量分析和相对定量分析。

3.4 脂肪酸哌嗪-嘧啶衍生物

图5 衍生试剂DMPP与脂肪酸的反应[54]Fig.5 Derivative reaction of DMPP with fatty acids[54]

Leng等[54-56]采用衍生试剂2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-嘧啶(2,4-Dimethoxy-6-piperazin-1-yl pyrimidine,DMPP)用于游离脂肪酸衍生，在碳二亚胺的作用下10 s内即可完成反应(图5)，结合HPLC-ESI-MS对人甲状腺组织和尿液中游离脂肪酸进行定性、定量分析。DMPP作为脂肪酸衍生试剂，具有衍生操作简单、反应迅速等优点，且其结构中含1个嘧啶环，ESI模式下可提高离子化效率，缺点是衍生后存在中间副产物和未衍生完全的衍生试剂。衍生后利用强酸性阳离子交换树脂吸附衍生中间产物和未衍生完全的衍生试剂，然后用乙醇冲洗，消除中间副产物和未衍生完全的衍生试剂的干扰，检测灵敏度和重现性以及检测通量均得到很大的提高和改进，检测灵敏度提高了375～1 000倍，检出限为160 nmol/L。此外，DMPP稳定同位素衍生化技术结合电喷雾-离子迁移谱-质谱(ESI-IM-MS/MS)成功地应用于人甲状腺组织中游离脂肪酸[56]的分析，利用不同的离子漂移时间和指示离子，结合同位素标记对游离脂肪酸进行定性和定量分析，该方法无需色谱分离即可对生物样品中16种游离脂肪酸进行检测，分析时间大大缩减，有利于大量生物样本的分析。

DMPP衍生化技术的反应条件温和，反应迅速，灵敏度高；但反应后存在大量的中间产物和未反应的衍生试剂，因此需先除去衍生中间产物和未衍生完全的衍生试剂后才能进质谱分析，否则会对检测器造成污染。

3.5 其他脂肪酸衍生物

2-硝基苯肼(2-Nitrophenylhydrazine,2-NPH)[57-58]常用于衍生脂肪酸等羧酸化合物，形成脂肪酸酰肼衍生物，这些衍生物在230 nm处有较强吸光度，可以使用HPLC-DAD-MS(Diode array detector,DAD,二极管阵列)进行检测。此外，3-硝基苯肼(3-Nitrophenylhydrazine,3-NPH)也被用于衍生丙酮酸和乳酸[59]，衍生后色谱分离效果和检出限显著提高。Han等[60]运用3-NPH衍生化技术结合高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法分析了2型糖尿病人排泄物中9种游离短链饱和脂肪酸(C2～C6)，通过优化衍生化条件和色谱分离条件，检测灵敏度、重现性和检测通量均得到很大的提高，线性范围为0.12～2 500 nmol/L，检出限为0.3～15 fmol。该衍生化技术的优点在于过量的衍生试剂和反应副产物不会干扰HPLC分析。

此外，氨甲基吡啶(2-Picolylamine,PA)[61-62]也被用于衍生羧酸类化合物，结合HPLC-ESI-MS方法，对生物样品中鹅去氧胆酸、胆汁酸、前列腺素E2和类前列腺素等羧酸化合物成功进行了定性和定量分析，其检测灵敏度提高了9～158倍。

表2列出了文献中报道的不同衍生化技术结合液相色谱-质谱法分析游离脂肪酸的研究及应用情况。

表2 不同衍生化技术结合液相色谱-质谱法在游离脂肪酸分析中的应用Table 2 Applications of different chemical derivatization technologies couple with HPLC-MS for the analysis of free fatty acids

(续表2)

SamplesDerivativeChromatographiccolumnMobilephaseAnalytesDetector&scanmodeReferenceRatliver,heart,braintissuesandhumanserum(大鼠肝脏、心脏、脑组织和人血清)N,N-二甲基乙二胺(d0/d4-DMED)AcquityUPLC-BEHphenylcolumn(2.1mm×50mm,1.7μm)A:Water-formicacid(100∶0.01,byvolume);B:Acetonitrile-methyl(7∶3,byvolume)类二十烷酸(HETEs,DHETs,EETs)ESI-MS/MS,DNLS&MRM(Doubleneutrallossscan&Multi-pleReactionMoni-toring)[48]Type2diabe-tespatientser-um(2型糖尿病患者血清)N,N-二甲基乙二胺(d0/d4-DMED)ShimadzuVP-ODScolumn(150mm×2.0mm,5μm)A:Water-formicacid(100∶0.01,byvolume);B:Acetonitrile脂溶性羧酸ESI-MS/MS,QNLS&MRM(Quadrupleneutrallossscan&MultipleReactionMonitoring)[49]Atheroscleroticplaquetissue(动脉粥样硬化斑块组织)N.N-二甲基乙醇胺(DMAE)和碘甲烷VarianPursuitDi-phenylcolumn(150mm×2mm,3μm)A:5mmol/LAmmoniumacetateinwater;B:5mmol/LAmmoniumace-tateinacetonitrile游离脂肪酸ESI-MS/MS,MRM(MultipleRe-actionMonitoring)[46]Humanthyroidtissueofthy-roidcarcinoma(甲状腺癌患者的甲状腺组织)2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-嘧啶(DMPP-d0/d6)ZorbaxSB-C8col-umn(2.1mm×100mm,1.8μm)A:Water;B:Acetoni-trile游离脂肪酸ESI-MS/MS,SRM[54]Humanurine(人尿液)2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-嘧啶(DMPP-d0/d6)ZorbaxSB-C8col-umn(2.1mm×100mm,1.8μm)A:Water;B:Acetoni-trile游离脂肪酸ESI-MS/MS,SRM[55]Carboxylicacidssolution(羧酸化合物标准品)2-硝基苯肼(2-NPH)Nucleosil120-5-C18reversed-phasecolumn(250mm×4mm)A:Water;B:Acetoni-trile羧酸化合物DAD-APCI-MS,negativeionmode[58]Type2diabe-tespatientfe-ces(2型糖尿病人排泄物)3-硝基苯肼(3-NPH)WatersBEHC18column(2.1mm×100mm,1.7μm)A:Water-formicacid(100∶0.01,byvolume);B:Acetonitrile-formicacid(100∶0.01,byvol-ume)短链饱和脂肪酸(Shortchainfattyacids,SCFAs,C2～C6)ESI-MS/MS,MRM(MultipleReactionMonito-ring),negativeionmode[60]Humansaliva(人唾液)氨甲基吡啶(PA)J'sphereODS-H80column(150mm×2.0mm,4μm)A:10mmol/LAmmoni-umformateinmethanol(byvolume);B:Metha-nol-water(7∶3,byvolume)鹅去氧胆酸、胆汁酸和前列腺素E2ESI-MS[61]Brainandliverfrommice(大鼠脑和肝脏)氨甲基吡啶(PA)和肼基吡啶(HP)ZorbaxSB-C18RapidResolutionHDcol-umn(2.1mm×100mm,1.8μm)A:Water-formicacid(99.9∶0.1,byvolume);B:Acetonitrile-formicacid(99.9∶0.1,byvolume)类前列腺素ESI-MS[62]

4 直接进样质谱技术

直接进样质谱法，即“鸟枪法”(Shotgun-MS)[64]是目前研究脂质组学较为常用的分析方法。脂质样品在提纯后，不经色谱柱分离，直接进样后进行质谱分析，能有效提高分析速度，电喷雾电离源(ESI)是目前最为常用的电离源。“鸟枪法”的主要原理是源内分离(Intra-source separation)，直接进样后根据脂质分子在不同pH值条件下的电荷差异性进行质谱离子源内分离，在正、负离子模式下分开检测不同脂质分子。鸟枪法具有样品前处理简单、样品用量少、分析时间短等特点，缺点是较难分析低丰度脂质。

图6 AMPP-α-亚麻酸(Δ9,12,15 18∶3)衍生化产物的质谱碎裂规律图[43]Fig.6 MS fragmentation pattern of derivatives for AMPP-α-linolenic acid(Δ9,12,15 18∶3)[43]

图7 丙酮与不饱和脂肪酸的光催化衍生化反应[65]Fig.7 Photochemical reaction of acetone with unsaturated fatty acid[65]

5 展 望

由于复杂基质样品中游离脂肪酸含量极低，具有强极性和弱挥发性，且其在质谱负离子检测模式下存在电离效率低、检测灵敏度不足等困难，而利用化学衍生化技术，可在游离脂肪酸中引入易电离的特定基团，改变游离脂肪酸结构，改善色谱行为和质谱响应，提高电离效率，减少复杂样品分析时的电离抑制，进而提高检测灵敏度。开发新型衍生化试剂，简化衍生化反应的步骤，减少衍生化副产物的干扰，提高衍生化反应的效率、专属性和稳定性；同时，衍生化产物易于产生丰富的二级碎片离子，利于脂肪酸位置异构体(双键位置异构，顺反异构等)的质谱结构鉴定，是今后基于衍生化技术的游离脂肪酸分析方法研究的重点和难点。

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Progress on Analysis of Free Fatty Acids by Chromatography-Mass Spectrometry Based on Chemical Derivatization

LIU Ming,WEI Fang*,XIE Ya,DONG Xu-yan,CHEN Hong,HUANG Feng-hong

(Hubei Key Laboratory of Lipid Chemistry and Nutrition,Oil Crops and Lipids Process Technology National & Local Joint Engineering Laboratory,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops of Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Oilseeds Processing of Ministry of Agriculture,Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China)

There are extremely low contents of free fatty acids in biological matrices.Lacking of ionized groups in the chemical structures of free fatty acids leadsnhance the response of mass spectrometry by modifying the chemical structures of free fatty to the poor ionization and sensitivity in mass spectrometry analysis.It is an effective way to e acids through derivatization technique.In recent years,chromatography-mass spectrometry combined with the chemical derivatization has been widely used in fatty acid analysis.The progresses in analysis of free fatty acids by chromatography-mass spectrometry based on chemical derivatization and its application are summarized in this paper.

free fatty acids; chemical derivatization; chromatography; mass spectrometry; research progress

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.019

O657;Q547

A

1004-4957(2017)10-1269-10

2017-04-12；

2017-05-18

国家自然科学基金项目(31571926)；农业部中央级公益性科研院所基本科研业务费(1610172016005)；中国农业科学院创新工程项目(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)；现代农业产业技术体系项目(CARS-13)

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魏 芳，博士，副研究员，研究方向：脂质分析与营养研究，Tel:027-86711669，E-mail:willasa@163.com，weifang@caas.cn