微波水解衍生高效液相色谱法测定饲料中的氨基酸

任晓宇，裴晓静，张少云，谢立娜，杜文博，锁 然

(河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000)

实验技术

微波水解衍生高效液相色谱法测定饲料中的氨基酸

任晓宇，裴晓静，张少云，谢立娜，杜文博，锁 然*

(河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000)

建立了一种微波水解衍生高效液相色谱同时测定饲料中17种氨基酸含量的方法。采用2,4-二硝基氯苯作为柱前衍生试剂，利用C18色谱柱分离。二极管阵列检测器进行检测，检测波长为360 nm，并对微波水解时间及温度进行优化。17 种氨基酸在2.5～50 mg/L范围内呈良好线性关系，相关系数为0.990 7～0.999 9；相对标准偏差为0.88%～4.2% ；加标回收率为90.6%～107.2%；检出限为0.15～2.37 mg/L。研究结果表明，150 ℃下微波水解16 min的结果与传统加热水解(110 ℃，24 h)的效果基本相同。该方法分析时间较短，灵敏度较高，可用于饲料中氨基酸含量的检测。

微波水解；氨基酸；高效液相色谱法；柱前衍生；饲料

饲料中的蛋白质是畜禽的重要营养物质，动物对蛋白质的需求源自对氨基酸的需求。因此，饲料中的氨基酸含量是衡量饲料质量的重要指标。氨基酸的国家标准检测方法[1]是以茚三酮为衍生剂试剂采用柱后衍生的离子色谱法。但该方法分析时间长，工作量大，且有一定的实验误差[2]。柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸具有分析时间较短、灵敏度高等优点[3],近年来的应用日益增多。对蛋白质中氨基酸的分析使用最为广泛的衍生方法是加热水解。但该法样品前处理时间较长，操作繁琐，劳动强度大[2]。

1975年Abu-Samra等[4]首次将微波技术应用于蛋白质的水解。微波水解是将样品、酸置于微波电磁场中，微波频率使极性分子取向快速变换，分子在来回转动过程中与周围分子高速碰撞摩擦，增加总能量,产生高热。容器密闭产生的高温高压加速了水解过程，但氨基酸的化学形式不变[5-7]。近年来，越来越多人应用微波消解仪对蛋白质进行水解[8-10]，该法可以一次处理多个样品，消耗时间短，可大大减少样品前处理的时间，降低检测成本，提高检测氨基酸的效率[11-13]，并且能达到与加热水解相同的结果[14]。

本研究将微波水解和衍生相结合测定饲料中的氨基酸。通过对微波水解的时间和温度进行优化，建立了一种快速检测饲料中氨基酸的方法。与常规水解相比，微波水解的效果较好。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

饲料：蛋白饲料，由河北农业大学动物科技学院提供。

17种氨基酸标准品：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、胱氨酸(Cys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)的纯度均≥99%，购于北京拜尔迪生物技术公司和美国 Sanland 公司；乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；2,4-二硝基氯苯(分析纯，纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司)；碳酸氢钠、碳酸钠、乙酸钠、三乙胺、冰乙酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪(低压梯度泵，自动进样器，PDA检测器)：美国Waters公司；TANK微波消解仪(海能仪器公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；高速中药粉碎机(浙江省兰溪市伟能达电器有限公司)；SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂)；电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；HW.SY21-K电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司)。

1.3 实验方法

1.3.1溶液的配制缓冲盐：0.53 g Na2CO3和0.42 g NaHCO3分别溶于10 mL水中，取700 μL Na2CO3加入到10 mL NaHCO3溶液中(pH 9.0)。

衍生剂：0.3 g 2,4-二硝基氯苯溶于1 mL乙腈中。

氨基酸标准溶液：分别准确称取17种氨基酸标准品各0.1 g(精确至0.000 1 g)置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，混匀，得到1 000 mg/L的17种氨基酸混合标准储备液，4 ℃保存。然后逐级稀释成2.5、5、10、25、50 mg/L的氨基酸混合标准液，4 ℃保存。

1.3.2样品水解加热水解法：将饲料样品经中央粉碎机粉碎，准确称取0.3 g(精确至0.000 1 g)于安培瓶中，加入10 mL的6 mol/L盐酸，在110 ℃烘箱中水解24 h。放置冷却至室温后，用容量瓶定容至10 mL，经离心后取上清液1 mL用真空抽干，最后用2 mL的0.1 mol/L盐酸水溶液回溶，涡旋混匀，备用。

微波水解法：准确称取0.3 g(精确至0.000 1 g)样品置于微波消解罐中，加入10 mL 6 mol/L盐酸，立刻安装消解罐，控制时间与温度进行提取与水解。水解完成后，用移液枪将水解液转移并用6 mol/L盐酸定容至10 mL容量瓶中，经离心后取上清液1 mL真空抽干，最后用2 mL 0.1 mol/L盐酸水溶液回溶，涡旋混匀，备用。

1.3.3氨基酸衍生取100 μL标准溶液或样品水解液于1.5 mL扎孔的小离心管中，加入200 μL缓冲盐和100 μL衍生剂，于90 ℃恒温水浴锅中反应90 min。待冷却后加入50 μL的10%乙酸调节pH值，最后用水定容至1 mL，混匀，取上清液过0.45 μm有机膜，供HPLC检测。

1.3.4色谱条件色谱柱：C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：40 ℃；检测波长：360 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。流动相：A为纯乙腈，B为2.5 g/L乙酸钠(含 1.5 mL 三乙胺，用冰醋酸调至pH 5.25)。梯度洗脱程序：0～10 min，18%A；10～15 min，18%～20%A；15～30 min，20%～34%A；30～35 min，34%～45%A；35～38 min，45%～55%A；38～42 min，55%～60%A；42～45 min，60%～18%A。

2 结果与讨论

2.1 微波水解条件的优化

2.1.1微波水解温度固定微波功率800 W，水解时间15 min，其他条件固定不变，考察了不同水解温度(130、140、150、160、170、180 ℃)对检测结果的影响[15]。结果表明，温度变化对天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的影响最大。随着温度的升高，这7种氨基酸的峰面积逐渐升高，当温度达到150 ℃时，峰面积达到最大；但继续升高温度，一些氨基酸会受到一定的破坏，导致峰面积逐渐降低。其余10种氨基酸受温度影响不大，而且在150 ℃时峰面积几乎最大。因此选择最佳微波水解温度为150 ℃。

2.1.2微波水解时间固定微波功率800 W，水解温度150 ℃，其他条件不变，考察不同水解时间(10、12、14、16、18、20 min)对17种氨基酸测定结果的影响[16]。结果表明，水解时间的变化对天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的影响较大。随着水解时间的增加，上述9种氨基酸的峰面积逐渐升高，当水解时间为16 min时峰面积达到最大，随后又逐渐降低。其余8种氨基酸虽受水解温度影响较小，但在16 min时均有较高的峰面积。因此选择最佳微波水解时间为16 min。

2.2 线性范围与检出限

分别取100 μL不同浓度的氨基酸标准溶液进行衍生后，供HPLC检测。以氨基酸的峰面积为纵坐标(y)，氨基酸的质量浓度为横坐标(x，mg/L)进行线性拟合，并以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)，结果如表1所示。由表1可知，17种氨基酸在2.5～50 mg/L范围内线性关系良好，相关系数在0.990 7～0.999 9之间，LOD为0.15～2.37 mg/L。

表1 17种氨基酸的线性方程、线性范围、相关系数及检出限Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and detection limits of the method for 17 amino acids

2.3 方法精密度、稳定性及重复性

取标准溶液100 μL衍生后，连续进样5次测定色谱峰峰面积，计算17种氨基酸的相对标准偏差(RSD)为0.16%～5.7%(n=5)。再将其衍生的标准品在室温放置0、1、2、3、4 d后进行测定，计算得RSD为0.18%～7.6%(n=5)；取同一样品5份，经提取、衍生后测定色谱峰峰面积，RSD为0.20%～4.6%(n=5)。以上结果表明，该方法精密度高、稳定性高、重现性好，可应用于饲料中17种氨基酸的分析。

2.4 加标回收率实验

准确称取5份已知含量的饲料样品0.3 g，分别加入一定量的氨基酸标准溶液，经衍生后供HPLC分析，进行回收率测定。由表2可知，饲料中氨基酸的平均回收率为90.6%～107.2%，RSD为 0.88%～4.2%。其中甲硫氨酸、赖氨酸以及酪氨酸的加标回收率较低，可能是由于高温部分氧化导致。该方法的准确度较高，适用于饲料中氨基酸的检测。

2.5 样品中氨基酸含量的测定

以2,4-二硝基氯苯为柱前衍生试剂，利用最佳的微波水解条件进行处理，采用HPLC检测饲料中的氨基酸，结果如表2所示，标准品及样品的色谱图如图1所示。

表2 饲料中氨基酸含量、回收率及其相对标准偏差(RSD)Table 2 The contents,recoveries and RSDs of amino acids in feed

图1 氨基酸标准品(A)与饲料样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of amino acids in 17 amino acids standard solution(A) and in the feed sample(B)the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

图2 微波水解与常规水解的比较Fig.2 Comparison of microwave hydrolysis and conventional hydrolysis

由表2可知，饲料中含量最高的氨基酸为谷氨酸，含量为89.21 mg/g；其次是天冬氨酸，含量为49.77 mg/g，这两种氨基酸是饲料中的主要氨基酸，占氨基酸总量的35%。

由图1可知，17种氨基酸标准溶液经衍生后分离效果较好，并且饲料样品中的氨基酸也被较好分离，因此，该方法适合用于饲料中氨基酸的测定。

2.6 微波水解与常规水解的比较

微波水解与常规水解结果的比较如图2所示。结果表明，微波水解与常规水解得到的各氨基酸含量基本相同，只有极少数的氨基酸效果不如常规水解，可能是加热过程中因温度高而被破坏[6]，但总体效果大致相同，因此微波水解能达到与常规水解相同的效果。

3 结 论

本研究建立了一种微波水解衍生高效液相色谱法测定饲料中17种氨基酸含量的方法。研究结果表明，150 ℃下微波水解16 min与传统加热水解能达到相同的效果，因此该方法可以取代传统的加热水解。该方法操作简单，消耗时间较短，有效降低了检测成本，提高了检测效率。实验准确度高，重现性、稳定性较好，而且17种氨基酸的衍生物均能较好分离，可用于饲料中的氨基酸检测。

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Determination of Amino Acids in Feed by High Performance Liquid Chromatography with Microwave Hydrolysis Derivatization

REN Xiao-yu,PEI Xiao-jing,ZHANG Shao-yun,XIE Li-na,DU Wen-bo,SUO Ran*

(College of Food Science and Technology,Agriculture University of Hebei,Baoding 071000,China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method with microwave hydrolysis derivation was developed for the simultaneous determination of 17 amino acids in feed.The method was based on pre-column derivatization with 2,4-dinitro-chlorobenzene.The compounds were separated on a C18column.And the conditions of microwave hydrolysis were optimized.The detection was performed using a diode array detector at 360 nm.The calibration curves of 17 amino acids all exhibited good linearities in the range of 2.5-50 mg/L.The correlation coefficients(r2) for the determination varied between 0.990 7 and 0.999 9 with the relative standard deviations(RSDs) of 0.88% to 4.2%,and the recoveries of 17 amino acids were in the range of 90.6%-107.2% with the limits of detection of 0.15-2.37 mg/L.The results showed that the results of microwave hydrolysis in 16 min at 150 ℃ are basically the same as those of traditional heating hydrolysis(110 ℃,24 h).With the advantages of short analysis time,high sensitivity,the method could be used for the determination of amino acids in feed.

microwave hydrolysis;amino acid;high performance liquid chromatography(HPLC);pre-column derivatization;feed

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.016

O657.7

A

1004-4957(2017)10-1255-05

2017-06-16；

2017-07-06

*

锁 然，博士，副教授，研究方向：食品分析，Tel：0312-7528195，E-mail：ransuo@qq.com