2-氨基葡萄糖-荧光染料-紫杉醇两性小分子单体的制备与表征

曹玉瑶,王维维，周宣羽,刘红艳,丁青根，单玲玲

宿州学院生物与食品工程学院，生物技术药物研究所，宿州，234000

2-氨基葡萄糖-荧光染料-紫杉醇两性小分子单体的制备与表征

曹玉瑶,王维维，周宣羽,刘红艳,丁青根，单玲玲*

宿州学院生物与食品工程学院，生物技术药物研究所，宿州，234000

在前期研究的基础上，选用已制备的2-氨基葡萄糖和荧光染料(2DA-FITC )作为“导向基团”靶向高表达葡萄糖转运受体GLUT1的肿瘤细胞和组织，并将其作为两性小分子的亲水端，共价偶联紫杉醇-谷氨酸(PTX-Glu)作为两性小分子疏水端，合成同时具有亲水性和疏水性的2-氨基葡萄糖-荧光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)两性小分子单体，并用LC-MS和核磁共振氢谱1H-NMR对2DA-FITC-PTX进行结构表征。实验结果证明已成功制备2DA-FITC-PTX两性小分子单体。

两性小分子；2-氨基葡萄糖； 紫杉醇

目前，临床上广泛使用的小分子和高分子药物都存在以下缺点：(1)小分子药物通过口服或注射给药，短时间内体内药物浓度远超过实际需求量，且无选择性；新陈代谢快、半衰期短、体内浓度很快降低而影响疗效，故需要大剂量给药，而过高的药物浓度又会增强药物的副作用[1]；(2)生物高分子药物在体内易被酶降解或失活，生物半衰期短， 需重复给药；还受到如免疫系统、组织、细胞膜等的限制，多数不易通过这些生物屏障，因而高分子药物的生物利用度较低[2]。因此，如何提高化学药物的局部浓度，减少全身毒副反应，一直是学界研究的热门课题。

近年来，国内外学者对难溶性化学药物剂型的研究取得一些进展，其中将难溶性化学药物构建成肿瘤靶向性纳米粒子载药系统是重要方法之一。用于药物输送的纳米粒子材料主要是高分子聚合物，载有药物的聚合物纳米粒子通常以胶体分散体的形式通过口服或经皮、皮下和肌肉注射，动脉注射，静脉点滴以及体腔黏膜吸附等给药途径进入人体[3-4]，但高分子聚合物由于分子量较大，在体内很难分散成单体形式给药[5-6]。因此，学界尝试制备结构规整的两性肿瘤靶向性小分子，在体内释放靶向性小分子作用于肿瘤组织。

本文在前期研究的基础上，将已制备的2-氨基葡萄糖-荧光染料(2DA-FITC)作为两性小分子单体的亲水端，共价偶联谷氨酸-紫杉醇前药中间体，并将其作为两性小分子单体的疏水端，合成两性小分子单体2-氨基葡萄糖-荧光染料-紫杉醇前药，采用LC-MS和1H-NMR对结构进行表征。

1 试剂与方法

1.1 实验试剂

2-氨基葡萄糖由实验室制备，紫杉醇(PTX)、谷氨酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]、荧光染料FITC均购买于sigma公司，二氯甲烷(DCM)和4-二甲氨基必定(DMAP)为AR级，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

核磁共振1H-NMR和质谱LC-MS检测仪器由中国药科大学生物医学工程研究室提供。

1.3 实验方法

1.3.1 谷氨酸-紫杉醇(Glu-PTX)的合成

称取100 mg(0.117 mmoL)PTX溶于15 mL的DCM，同时加入59.7 mg (0.1404 mmol，1.2 eqv)Fmoc-Glu(OtBu)-OH和14.29 mg DMAP(0.117mmoL)，将44.85 mg(0.234mmoL,2eqv)EDC溶于10 mL DCM中，在冰浴条件下，将10 mL溶于EDC溶液，并缓慢滴入到PTX反应体系中，大约25 min滴加完毕，除去冰浴，室温下搅拌26 h，用TLC示踪。待反应完后，用同体积的DCM稀释，然后用同体积的蒸馏水洗2次，加入无水硫酸镁干燥，真空旋蒸后得晶状体产物谷氨酸-紫杉醇，其结构用LC-MS进行分子量鉴定。

1.3.2 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Glu(OtBu)-PTX)中间体的制备

将产物Fmoc-Glu(OtBu)-PTX中溶于8 mL DCM，并加入100 μL，在室温下搅拌过夜，直至出现浑浊，然后用TLC示踪。将产物再次真空旋蒸除去溶剂，再用乙醚萃取(OtBu溶于乙醚中)，放入冰箱过夜，将乙醚去除，烘干产物，即得脱去了OtBu的Fmoc-Glu(COOH)-PTX白色晶体。将0.01 mmol Fmoc-Glu(COOH)-PTX溶于DMF中，加入EDC和NHS(摩尔比1∶1.2∶2)活化Fmoc-Glu(COOH)-PTX的羧基，室温搅拌4 h后，加入0.01 mmoL 2DA，室温下搅拌过夜，将反应液经硅胶柱纯化，得到纯化的2-氨基-谷氨酸-紫杉醇(2DA-Fmoc-Glu-PTX)，将2DA-Fmoc-Glu-PTX溶于DCM体系中，再加入2 mL哌啶(使哌啶为总体积的20%)，用乙醚萃取，用TLC示踪，得到2DA-NH2-Glu-PTX前药，并鉴定其化学结构。

1.3.3 2-氨基葡萄糖-荧光染料-紫杉醇(2DA-FITC-PTX)两性小分子单体的制备

将0.1 mmoL 2DA-NH2-Glu-PTX前药中加入7 mL DCM溶解后，加入0.1 mmoL荧光染料FITC，室温下搅拌过夜，将反应液经G15纯化，去除没有共价偶联的2DA-NH2-Glu-PTX和FITC片段，得到纯化的2氨基葡萄糖-荧光染料紫杉醇前药(2DA-NH2-Glu-PTX-FITC)小分子单体，-20℃储存备用。

1.3.4 靶向性紫杉醇前药单体及中间体的表征

用核磁共振氢谱1H和LC-MS对靶向性紫杉醇药前药中间体和单体进行化学结构鉴定。

2 结果与讨论

2.1 谷氨酸-紫杉醇中间体(Glu-PTX)结构鉴定

纯化后的NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析，其质谱鉴定的结果与NH2-Glu(OtBu)-PTX的理论分子完全一致，NH2-Glu(OtBu)-PTX:MS (ESI,m/z): 1283.4([M+H]+) ，如图1。证明已成功合成谷氨酸-紫杉醇中间体。

图1 LC-MS鉴定谷氨酸-紫杉醇中间体的分子量 NH2-Glu(OtBu)-PTX: MS (ESI, m/z): 1283.4([M+H]+)

2.2 2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)前药结构鉴定

用LC-MS对2-氨基葡萄糖-紫杉醇(2DA-PTX)分子量进行鉴定，结果显示其质谱鉴定的结果与2DA-PTX前药理论上分子量完全一致，2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68([M+H]+)，如图2。由此可证明2DA-PTX前药已成功地合成。

图2 LC-MS鉴定2-氨基葡萄糖-紫杉醇分子量 2DA-PTX:MS(ESI,m/z):1656.68 ([M+H]+)

2.3 两性小分子2-氨基葡萄糖-荧光染料紫杉醇(2DA-FITC-PTX )单体结构鉴定

用核磁共振氢谱1H鉴定2-氨基葡萄糖-荧光染料紫杉醇前药单体结构，从氢谱图可以看出亲水端与疏水端共价偶联2-OH位置在4.77 ppm到5.44 ppm之间(图3)，证明小分子单体的合成。

图3 核磁氢谱鉴定小分子2-氨基葡萄糖-荧光染料紫杉醇前药单体

3 结 论

在传统抗肿瘤药物剂型中，存在包封率低、易渗漏、稳定性差、毒副作用大和靶向性差等问题[7]。两性小分子自组装靶向性纳米粒子载药系统，在高效率载药的同时，在酸性条件下也可生物降解成小分子靶向性前药释放紫杉醇原药。纳米粒子药物除具有低毒、高效、缓释、长效，能识别变异细胞，药物稳定性好，药物释放后的高分子载体无毒，不会长期积累在体内，以及副作用小等优点外[8], 还具有更强的定向释放能力, 是各种药物的较佳替代品。本文在前期研究的基础上，用2-氨基葡萄糖-荧光染料(2-DA-FITC)作为两性小分子单体的“导向基团”和亲水端，共价偶联谷氨酸-紫杉醇[(2DA-Glu(OtBu)-PTX]中间体作为两性小分子单体的疏水端，制备两性小分子单体2-氨基葡萄糖-荧光染料-紫杉醇前药(2DA-FITC-PTX)，旨在为进一步构建靶向性纳米药物传递体系提供实验依据。

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(责任编辑：汪材印)

TP273

A

1673-2006(2017)09-0115-03

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.09.027

2017-07-05

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510379027，201410379014)；安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2014A249)；宿州学院科研平台开放课题(2016ykf08)。

曹玉瑶(1995-)，女，安徽宿州人，研究方向：肿瘤靶向性药物的合成与应用。

*通信作者：单玲玲(1971-)，女，安徽宿州人，博士，副教授，研究方向：抗肿瘤药物及其新剂型。