IGF-1对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制

陆蔚天,孙善全,许士叶,黄 娟*

(1重庆医科大学神经科学研究中心,重庆 400016;2重庆医科大学人体解剖学教研室;*通讯作者,E-mail:huangjuan@cqmu.edu.cn)

IGF-1对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制

陆蔚天1,2,孙善全1,2,许士叶1,2,黄 娟1,2*

(1重庆医科大学神经科学研究中心,重庆 400016;2重庆医科大学人体解剖学教研室;*通讯作者,E-mail:huangjuan@cqmu.edu.cn)

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对β-淀粉样蛋白25-35(amyloid-beta protein,Aβ25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用及可能的信号机制。 方法 以10 μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型。实验分为对照组、Aβ25-35处理组、IGF-1+Aβ25-35处理组。条件孵育24 h,采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)检测细胞存活率,Western blot检测各组细胞磷酸化-Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白表达水平。 结果 MTT法检测显示,10 μmol/L Aβ25-35孵育24 h,PC12细胞存活率为(39.8±3.7)%,与对照组[(100.0±2.3)%]相比显著下降(P<0.05)。IGF-1+Aβ25-35处理组,PC12细胞存活率为(56.4±4.2)%,与Aβ25-35处理组[(39.8±3.7)%]相比显著增高(P<0.05)。Western blot显示,IGF-1+Aβ25-35处理组p-Akt蛋白表达水平(0.794±0.037)高于Aβ25-35处理组(0.493±0.050),差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论 IGF-1能抑制Aβ25-35所导致的PC12细胞凋亡,其保护作用可能与上调Akt磷酸化的表达有关。

胰岛素样生长因子1; 淀粉样蛋白; 细胞凋亡; PI3K-Akt信号通路

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的渐进性、不可逆的神经系统退行性疾病。由淀粉样蛋白(amyloid-beta protein,Aβ)聚集在神经元外形成的老年斑是AD最明显的病理特征之一。已有的大量研究表明,Aβ可导致AD患者脑内出现氧化应激、线粒体功能障碍、神经元凋亡等诸多不良后果[1,2]。淀粉样蛋白25-35位的氨基酸序列(Aβ25-35)是Aβ产生神经毒性的必要结构[3]。用Aβ25-35处理细胞或者动物,可诱导细胞产生氧化应激、炎症反应、诱导细胞凋亡,并引起动物出现认知功能障碍等AD特征性表现[4,5]。因此,阐明Aβ对AD神经毒性的发生机制,并探寻有效应对Aβ毒性作用的可靠对策,成为预防和治疗AD的关键所在。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 1,IGF-1)是胰岛素家族的成员之一,与胰岛素在分子结构和功能上具有高度同源性。在中枢神经系统内,IGF-1作为重要的神经调节因子,参与调节细胞发育存活、能量代谢和学习记忆等重要生理过程[6]。已有研究表明,IGF-1可以通过加快清除脑内Aβ,缓解记忆障碍等,从而对AD发挥保护作用[7-9]。但是,目前对于IGF-1通过哪些信号通路发挥AD细胞保护作用仍在研究之中。因此,本实验以Aβ25-35处理PC12细胞制作AD细胞模型,并探讨IGF-1对Aβ25-35所致PC12细胞凋亡的保护作用及潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

1.2 细胞培养

细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,在37 ℃、5%CO2培养箱中培养,每2-3 d传代1次。取对数生长期细胞进行实验。实验分为3组:对照组、Aβ25-35组(加入终浓度为10 μmol/L的Aβ25-35处理)、IGF-1+Aβ25-35组(加入终浓度为100 ng/ml的IGF-1和10 μmol/L的Aβ25-35共同处理)。条件培养24 h,进行后续检测。

1.3 MTT法检测细胞存活率

将细胞按1×105个/ml浓度接种于96孔板,每孔100 μl,对照组加入等量培养液,每组设5个复孔。终止培养前4 h每孔加入5 mg/ml的MTT10 μl,置于培养箱37 ℃孵育4 h。去除上清,每孔加入150 μl DMSO,充分吹打甲臜结晶后置于摇床混匀10 min,用酶标仪检(BIO-RAD Model)检测每孔细胞A450 nm处吸光度值。以对照组吸光度为100%,其余实验组细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.4 Western blot检测蛋白表达

弃去培养液,用4 ℃的PBS洗涤细胞2次。加入Western细胞裂解液吹打细胞。收集细胞,10 000×g离心5 min。采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白(20 μg)进行10%的聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE),100 V恒压电泳1 h,350 mA转膜56 min,5%脱脂奶粉封闭30 min,加入小鼠抗大鼠一抗(1 ∶1 000)4 ℃过夜,PBST洗3次,每次10 min;加入羊抗小鼠二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育60 min,PBST洗3次,每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的DAB显色。用Quantity one软件测定各组目的蛋白条带的灰度值,用p-Akt/Akt条带比值作为蛋白相对值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 IGF-1抑制Aβ25-35对PC12细胞诱导的细胞凋亡

用10 μmol/L的Aβ25-35孵育24 h,PC12细胞存活率为(39.8±3.7)%,与对照组[(100.0±2.3)%]相比显著下降(P<0.05)。同时给予100 ng/ml IGF-1和10 μmol/L Aβ25-35处理后,细胞存活率为(56.4±4.2)%，与单独Aβ25-35处理组[(39.8±3.7)%]相比,细胞存活率升高(P<0.05,见图1)。

与对照组相比,*P<0.05;与Aβ25-35组相比,#P<0.05图1 IGF-1抑制Aβ25-35对PC12细胞诱导的细胞凋亡Figure 1 IGF-1 inhibited the Aβ25-35-induced apoptosis of PC12 cells

2.2 IGF-1促进Aβ25-35所致PC12细胞损伤模型中Akt的磷酸化

对照组PC12细胞p-Akt表达水平较低(0.307±0.037),Aβ25-35处理后,PC12细胞p-Akt相对表达量升高(0.493±0.050),差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。IGF-1+Aβ25-35组PC12细胞p-Akt表达水平最高(0.794±0.037),与Aβ25-35组相比,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。

与对照组相比,*P<0.05;与Aβ25-35组相比,#P<0.05图2 免疫印迹检测p-Akt蛋白在各组中的表达Figure 2 Expression of p-Akt protein in PC12 cells by Western blot

3 讨论

在众多导致AD的因素中,Aβ聚集形成淀粉样变性(amyloidosis)是目前公认的最为关键的一个致病因素。Aβ可以引起AD患者脑内突触功能障碍、神经炎性反应、氧化应激、神经元丢失和认知障碍等后果。AD患者脑内Aβ过度聚集并且在神经元外沉积形成老年斑,是AD特征性标志之一[10]。本研究采用淀粉样蛋白神经毒性片段Aβ25-35处理PC12细胞建立AD细胞模型,并用IGF-1干预,以探讨IGF-1对AD的保护作用及可能机制。本实验中,加入10 μmol/L的Aβ25-35处理后,与对照组相比,PC12细胞存活率显著下降,结果证实Aβ25-35对PC12细胞生长具有抑制作用,采用Aβ25-35处理可作为AD的细胞模型。

在脑内,IGF-1通过广泛表达于大、小鼠皮质、海马、间脑和嗅球等部位的IGF-1受体发挥作用[8]。研究显示,IGF-1能够促进神经细胞的增殖及存活,对细胞具有保护作用[11,12]。本研究中,加入IGF-1处理可以显著减少Aβ25-35对PC12细胞造成的细胞凋亡,结果提示IGF-1对PC12细胞发挥保护作用。研究显示IGF-1通过与IGF-1受体结合后可激活磷脂酰肌醇3-羟基激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt等下游信号通路以发挥神经保护作用。PI3K-Akt组成的信号通路是细胞内的一条重要信号通路,可以调节与细胞生长、分化与迁移及凋亡等重要过程中基因的表达,并启动下游级联系统[12]。研究显示,IGF-1可以激活PI3K信号通路,从而磷酸化目的分子Akt,磷酸化的Akt激活或抑制下游靶蛋白,如葡萄糖合成激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3β)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Bad、caspase-9等,参与介导葡萄糖转运、脂肪和蛋白合成,进而调控细胞存活与分化、血管生成和能量代谢等重要过程[13-15]。

已有研究提示,PI3K-Akt信号通路可能通过以下多种机制参与调控细胞凋亡:①抑制Forkhead box O磷酸化及向细胞核的转移,从而阻止FOXO调控促凋亡基因的转录[15]。②Akt磷酸化后抑制促凋亡蛋白家族成员Bad的活性[16]。③可通过阻止Bax转移至线粒体,以减少细胞色素C的释放,从而达到细胞保护的作用[17]。④该通路可抑制GSK-3β活性,抑制糖原合成,减少具有神经毒性tau的磷酸化,从而发挥神经保护作用[18]。现有研究表明,体内多种分子如表皮生长因子、IGF-1R等可通过刺激PI3K-Akt信号通路来调节神经元的存活及死亡。研究显示,若细胞内、外因素刺激干扰IGF-1信号,可引起PI3K通路转导紊乱,导致出现Aβ沉积、tau过度磷酸化、氧化应激,甚至神经元凋亡等不良后果[18]。本研究结果显示IGF-1处理可增加PC12细胞p-Akt的表达,同时显著抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。据此推测,IGF-1通过激活PI3K-Akt信号通路,从而发挥对PC12细胞的保护作用。

综上所述,本研究结果显示IGF-1可抑制Aβ25-35诱导PC12细胞发生凋亡,其保护作用可能与激活PI3K-Akt信号通路有关。AD发生发展过程中,患者脑内IGF-1水平及PI3K-Akt信号通路异常与神经元的变性丢失紧密相关。本研究结果为进一步开展AD的药物研发提供了实验数据。

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ProtectiveeffectofIGF-1onAβ25-35-inducedapoptosisofPC12cellsanditsmechanism

LU Weitian1,2,SUN Shanquan1,2,XU Shiye1,2,HUANG Juan1,2*

(1InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2DepartmentofHumanAnatomy,ChongqingMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:huangjuan@cqmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the protective effect of insulin-like growth factor 1(IGF-1) on amyloid-beta protein 25-35 (Aβ25-35)-induced neurotoxicity in PC12 cells and its possible mechanisms.MethodsPC12 cells were treated with 10 μmol/L Aβ25-35to establish the cell model of Alzheimer’s disease (AD). PC12 cells were divided into three groups: control group, Aβ25-35group and IGF-1+Aβ25-35group. After 24 h treatment, the cell viability was detected by MTT assay. The expression of phospho-Akt protein was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the viability in Aβ25-35group was significantly decreased[(100.0±2.3)%vs(39.8±3.7) %,P<0.05]. Meanwhile, the cell viability in IGF-1+Aβ25-35group was significantly higher than that in Aβ25-35group [(56.4±4.2)%vs(39.8±3.7)%,P<0.05]. Western blot results showed that the expression of phospho-Akt in IGF-1+Aβ25-35group(0.794±0.037)was higher than that in Aβ25-35group(0.493±0.050,P<0.05).ConclusionIGF-1 may protect PC12 cells against Aβ25-35-induced apoptosis by up-regulating the expression of phospho-Akt.

insulin-like growth factor 1; amyloid-β protein; apoptosis; PI3K-Akt signaling pathway

R363

A

1007-6611(2017)09-0900-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.007

国家自然科学基金资助项目(81601051);重庆市基础与前沿研究计划项目(cstc2016jcyjA0172);重庆市渝中区科技计划项目(20140115);重庆市教委科学技术研究项目(KJ1600222);重庆医科大学国家自然科学基金预研资助项目(NSFYY201525)

陆蔚天,男,1979-05生,博士,副教授,E-mail:weitianlu@cqmu.edu.cn

2017-06-08