白藜芦醇对db/db糖尿病鼠视网膜病变的作用

魏 明，甘 露，邓雅婷，李宇金，迪明博

(1西安医学院药理学教研室,西安 710021;2陕西省人民医院妇科;3西安医学院药学系;*通讯作者,E-mail:weiming@xiyi.edu.cn)

白藜芦醇对db/db糖尿病鼠视网膜病变的作用

魏 明1*，甘 露2，邓雅婷1，李宇金3，迪明博3

(1西安医学院药理学教研室,西安 710021;2陕西省人民医院妇科;3西安医学院药学系;*通讯作者,E-mail:weiming@xiyi.edu.cn)

目的 观察白藜芦醇对db/db糖尿病鼠视网膜病变的影响。 方法 选用18周龄db/db糖尿病鼠,db/m型同性同窝瘦型鼠为对照。将db/db鼠随机分为:db/db组,白藜芦醇高(50 mg/kg)、低剂量(10 mg/kg)治疗组,每组6只,药物连续灌胃2个月。观察一般状态,测空腹血糖3次,视网膜电流图(ERG)检测,2个月末处死各组鼠。HE染色观察视网膜病理改变,Western blot检测VEGF蛋白表达。 结果 与db/db组比较,白藜芦醇治疗组血糖水平显著降低(P<0.05),尤其以高剂量组为著,HE染色db/db组鼠视网膜内界膜粗糙,厚度变薄,白藜芦醇治疗后显著改善。与db/db组比较,白藜芦醇治疗组主要表现为暗适应3.0反应中a波、b波的潜伏期缩短(P<0.05)。Western blot结果显示db/db组VEGF蛋白表达显著升高,但白藜芦醇治疗后表达显著降低(P<0.05)。 结论 白藜芦醇能降低db/db鼠血糖,改善db/db鼠视网膜功能,其机制可能通过下调血管生成因子VEGF蛋白表达来发挥作用。

白藜芦醇; db/db鼠; 糖尿病视网膜病变; VEGF

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)并发症中最严重的微血管病变之一,长期慢性高血糖损伤导致视网膜组织形态和功能异常,促进新生血管生成。研究表明,影响血管功能的多种细胞因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),以及低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)在DR时均有明显提高,对DR眼底血管增生、细胞凋亡有重要作用,影响着DR的发生发展及预后,抑制其表达,可以减少DR新生血管的形成,延缓DR的进程。文献报道,白藜芦醇(resveratrol,Res)通过抑制血小板聚集合组织因子的表达、促进血管舒张、抑制脂质过氧化、抑制血管平滑肌细胞增殖等保护心血管,但目前尚未见其对于治疗DR方面的报道。本研究以db/db鼠为模型,观察白藜芦醇对DR的保护作用以及对VEGF蛋白表达的影响,为白藜芦醇的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18周龄雄性db/db鼠,SPF级,体质量(54±4)g。BKS-db+/+雄性db/m鼠同窝瘦型鼠为对照,SPF级,体质量(24±1)g,购自南京模式动物中心,合格证号SCXK(苏)2010-0001。鼠饲养于SPF级动物实验室,恒温(22 ℃±2 ℃)、恒湿(55%±5%),照明情况为12 h ∶12 h(光照 ∶黑暗)。每笼6只,实验期间自由饮水摄食。

1.2 药物及仪器

白藜芦醇购自四川维克奇生物科技有限公司,纯度≥98%,批号201004,加生理盐水配置乳浊液后灌胃。BH-2型光学显微镜(日本Olympus公司),Centrifuge 5810R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司),罗氏血糖仪(德国ACCUCHEK Performa公司),7100型全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.3 动物分组及给药

以db/m鼠为对照,db/db鼠随机分为db/db组、白藜芦醇高(50 mg/kg)、低剂量(10 mg/kg)治疗组,每组6只,灌胃给药,每天1次,连续60 d。

1.4 一般状态观察

观察鼠活动状态,记录鼠平均进食量和饮水量,每2周称体质量1次。

1.5 视网膜组织切片HE染色

db/m鼠为对照,db/db鼠组、db/db鼠白藜芦醇高、低剂量治疗组,每组6只,摘取眼球,制作石蜡切片,观察视网膜病理组织结构及血管病变情况。具体步骤如下:①固定:0.5%戊巴比妥钠过量麻醉处死,摘除完整眼球于全眼球固定液中室温固定24-72 h;②梯度酒精中脱水;③二甲苯溶液透明;④浸蜡;⑤标本矢状位包埋于石蜡中;⑥修块;⑦用石蜡切片机切5 μm石蜡切片;⑧HE染色。

1.6 空腹血糖(FBG)水平测定

动物分别在实验的第4,6,8周上午8时开始,禁食6 h,剪尾取血于血糖试纸上,血糖仪检测并记录结果。

1.7 视觉电生理检查

取db/m组、db/db组和db/db白藜芦醇高剂量及低剂量治疗组,每组各6只,按小动物视觉电生理标准化检查方案,用RETI-SCAN视觉电生理检查系统对各组鼠进行ERG检测。具体步骤如下:将各组鼠置于暗箱中暗适应12 h,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,托吡卡胺散瞳,完全麻醉瞳孔散大后,电极置于视觉电生理检查专用动物平台上,安放3根电极,尾部皮下插入接地电极,左侧颊部插入参考电极,左眼角膜上放置记录电极,ERG标准反应检测,由1名视觉电生理检测经验丰富的技术人员统一读取结果。

1.8 视网膜组织VEGF蛋白表达检测

按照db/m鼠组,db/db鼠组、db/db鼠白藜芦醇高、低剂量治疗组,每组3只,摘取眼球,分离视网膜,提取视网膜组织总蛋白,采用Western blot测定各组鼠视网膜组织VEGF蛋白的表达量。具体步骤包括:取材;视网膜总蛋白提取;BCA法蛋白定量上样,电泳,转膜,封闭,孵一抗,孵二抗,化学发光,灰度分析。

1.9 统计方法

2 结果

2.1 一般体征的变化

db/m组精神状态良好,动作自如。与db/m组比较,db/db组喜静蜷卧,形体肥硕,行动迟缓,精神萎靡,饮水量、进食量增加,体质量显著增加(P<0.01)。与db/db组比较,白藜芦醇高剂量组活动增加,进食、饮水量明显减少,体质量无显著差异。

2.2 视网膜组织HE染色结果

造模及白藜芦醇治疗2个月,麻醉后取各组鼠眼球及视网膜,石蜡切片,进行HE染色。db/m组视网膜内界膜光滑,未见明显突破内界膜的血管内皮细胞。与db/m组比较,db/db组鼠视网膜组织厚度变薄,神经节细胞数目减少,内界膜粗糙,血管内皮细胞排列杂乱,呈簇状分布,而白藜芦醇治疗后有显著改善。

2.3 白藜芦醇对FBG的影响

给药2个月后,与db/db组比较,高、低剂量组FBG水平显著降低(P<0.05),提示白藜芦醇有一定的降血糖作用,且随着给药时间的延长,降血糖作用越显著,尤以高剂量组为著,第8周与第4周血糖水平有明显差异(P<0.05,见表1)。

图1 各组视网膜组织形态学变化(HE,×400)Figure 1 Morphological changes of retinal tissues in each group by HE staining (×400)

组别给药4周给药6周给药8周db/m组7．51±0．9126．31±1．206．85±1．58db/db组28．09±3．44∗27．60±2．77∗29．24±3．72∗高剂量组19．55±3．52#17．72±3．56#14．20±3．26#△低剂量组20．81±4．35#19．20±3．78#18．03±3．60#

与db/m组比较,*P<0.05;与db/db组比较,#P<0.05;同组与第4周比较,△P<0.05

2.4 视觉电生理检查结果

为检测白藜芦醇对db/db鼠视网膜功能的影响,在给药50 d对各组鼠进行ERG检测。暗适应3.0反应中,与db/m组相比,a波、b波的潜伏期在db/db组明显延长(P<0.05),而白藜芦醇治疗组和db/m组间则无明显差异(P>0.05,见表2);四组间的a波幅值没有差异(P>0.05,见表3);db/db组和db/db治疗组的b波幅值明显大于db/m组(P<0.05),但db/db组与db/db治疗组之间的差异无

组别暗适应30反应暗适应30Ops反应a波潜伏期b波潜伏期O2波潜伏期db/m组1600±126 8033±4273750±404db/db组2067±378∗ 10780±1831∗4800±283∗高剂量组1767±082# 8650±628#4788±427#低剂量组1871±082# 9150±691#4371±427#

与db/m组比较,*P<0.05;与db/db组比较,#P<0.05

统计学意义(P>0.05,见表3)。暗适应3.0 Ops反应中,O2子波的潜伏期和幅值在db/db组和白藜芦醇组之间有明显差异,与db/m组相比,db/db和db/db治疗组均表现为显著的潜伏期延长、幅值升高。

组别暗适应30反应暗适应30Ops反应a波幅值 b波幅值O2波幅值db/m组20920±626040330±109204750±1404db/db组15070±6780∗17780±7831∗ 850±583∗高剂量组18067±4482#22650±4680#1988±427#低剂量组17067±3082#21650±3628#1518±427#

与db/m组比较,*P<0.05;与db/db组比较,#P<0.05

2.5 视网膜组织VEGF表达

为检测db/db鼠及db/db鼠白藜芦醇治疗组视网膜中VEGF表达情况的影响,采用Western blot对各组鼠视网膜组织VEGF蛋白的表达量进行测定。结果显示,VEGF蛋白在四组均有表达,其中以db/db鼠组VEGF相对表达最高,白藜芦醇治疗后VEGF表达相对表达量显著降低,尤其以白藜芦醇高剂量组为显著(P<0.05,见图2)。

与db/m组比较，*P<0.05;与db/db组比较，#P<0.05图2 各组小鼠视网膜组织VEGF蛋白表达Figure 2 The expression of VEGF protein in retinal tissues of mice in different groups

3 讨论

糖尿病研究多采用人造动物模型,早在20世纪60年代美国Jackson实验室在C57BL/Ks(db/db)品系小鼠体内发现了糖尿病突变基因(db),它是位于小鼠4号染色体的瘦素受体基因发生突变所致。从而确定了该糖尿病小鼠是目前人类2型糖尿病研究适用的动物模型之一。

长期慢性高血糖损伤导致视网膜组织形态和功能异常,促进新生血管生成。同时,微循环障碍可对神经视网膜功能产生影响。视觉电生理检查中的ERG可以反映包括视网膜血管及神经组织细胞在内整个视网膜的功能状态,临床诊疗过程中,应用ERG检查发现即使是轻度的ROP,光感受器细胞功能也会受到影响,同时视网膜血管及与之联系紧密的光感受器后神经元也会受累。

根据国际临床视觉电生理标准方案,对各组鼠进行了ERG标准5项检测。其中,暗适应0.01反应主要反映视网膜光感受器细胞中视杆细胞的功能,明适应3.0反应和明适应3.0闪烁光反应主要反映视锥系统的功能,暗适应3.0反应代表视杆和视锥系统的综合电反应。其中a波起源于光感受器细胞层,代表了外层视网膜的功能;b波主要起源于双极细胞,反映了内层视网膜的功能情况。暗适应3.0 Ops反应则与视网膜微循环的状态相关。

ERG检查表明,与db/m组相比,db/db组和白藜芦醇治疗组的波形均有明显异常,波幅显著下降,说明在视网膜血管病变的前提下,光感受器细胞、感受器后神经元和视网膜微循环均受到不同程度的损害,整个视网膜功能较差。在血管病变条件下,主要表现为暗适应3.0反应中a波、b波潜伏期的延长,说明整个视网膜功能进一步下降。其可能的原因为:糖尿病视网膜血管病变,使神经细胞的血供更差,再加上炎症的作用,使得a波和b波潜伏期延长,而白藜芦醇通过改善视网膜血管病变,从而改善视网膜功能[8]。

研究表明,VEGF是一种血管生成的刺激因子,刺激血管内皮细胞的增殖,对眼部的血管生成起重要的调节作用,VEGF能够特异性作用于内皮细胞,刺激内皮细胞胶原蛋白分泌及细胞增殖[9]。HIF-1α是在缺氧状态下产生的一种调节因子,对缺氧状态下视网膜血管的形成起着关键作用,是缺氧信号传导通路的中的重要因子[10]。研究表明,DR患者在视网膜中VEGF与HIF-1α的表达均有显著提高,在严重缺氧信号的刺激下,强烈激活HIF-1α信号通路,使促血管生成物质释放更多,血管内皮细胞过度增殖,形成更多的病理性新生血管[18]。VEGF是HIF-1α信号通路下游的重要分子,具有很强的促血管生成活性,在血管形成中起关键作用。用Western blot对各组视网膜VEGF蛋白表达,发现第60天时db/db组的VEGF表达高于db/m组,对于糖尿病视网膜病变的加重,可能是炎症通过加剧第一阶段血管闭塞,加重视网膜缺血缺氧,进而上调VEGF来实现的。而白藜芦醇通过减弱VEGF的表达改善糖尿病视网膜病变。

本研究证明了白藜芦醇能降低db/db鼠血糖,改善db/db鼠视网膜功能,其机制可能通过下调血管生成因子VEGF蛋白表达来发挥作用，具体的分子机制还有待进一步的研究。该研究结果将为临床应用白藜芦醇治疗糖尿病视网膜病变提供新的理论依据。

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Effectsofresveratrolondiabeticretinopathyindb/dbtype2diabeticmice

WEI Ming1*,GAN Lu2,DENG Yating1,LI Yujin3,DI Mingbo3

(1DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofGynecology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;3DepartmentofPharmacy,Xi’anMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:weiming@xiyi.edu.cn)

ObjectiveTo observe the effect of resveratrol on retinopathy of db/db diabetic mice.MethodsThe 18-week-old db/db diabetic mice and db/m mice(control) were chosen. Db/db mice were randomly divided into three groups(n=6 in each group): db/db group, resveratrol high(50 mg/kg) and low dose(10 mg/kg) group. Resveratrol were given for 2 months. The states of mice were observed, the fasting blood glucose level was measured three times, and the retinal current(ERG) was detected. Mice were sacrificed at the end of 2 months. HE staining was used to observe the pathological changes of retina and the expression of VEGF protein was detected by Western blot.ResultsCompared with db/db group, the blood glucose levels were significantly decreased in resveratrol treatment groups(P<0.05), especially in high dose group. The results of HE staining showed that the inner retina was rough and thinning in db/db group, and it was improved significantly in resveratrol groups.Visual electrophysiological test results showed that compared with db/db group, the latency of a wave and b wave was shortened in dark adaptation 3.0 reaction in resveratrol groups(P<0.05). Western blot results showed that the expression of VEGF protein in db/db group was significantly increased compared with control group, but the expression of VEGF was significantly decreased in resveratrol groups.(P<0.05)ConclusionResveratrol can reduce the blood glucose and improve the retinal function in db/db mice, which may be related to the decrease of expression of VEGF protein.

resveratrol; db/db mice; diabetic retinopathy; VEGF

R587.2

A

1007-6611(2017)09-0922-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.012

国家自然科学基金青年基金资助项目(8140140387)；陕西省自然科学基础研究项目(2016JM8046，2014JQ2-8055)；陕西省卫计委重点项目(2014A)；西安医学院校级重点建设学科资助项目(2015097)；西安医学院博士科研启动基金项目(2016DOC22)

魏明，男，1978-07，博士，讲师，E-mail:weiming@xiyi.edu.cn

2017-06-05