ECT2和P21蛋白在乳腺癌中的表达及意义

王宏坤，郑绘霞，梁建芳，肖 虹

(山西医科大学第一医院病理科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:huixiazheng62@126.com)

ECT2和P21蛋白在乳腺癌中的表达及意义

王宏坤，郑绘霞*，梁建芳，肖 虹

(山西医科大学第一医院病理科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:huixiazheng62@126.com)

目的 探讨乳腺癌中ECT2和P21蛋白的表达及其临床意义。 方法 选取133例乳腺癌和80例正常乳腺组织,采用免疫组织化学EnVision的方法检测ECT2和P21蛋白在上述组织中的表达情况,分析二者在乳腺癌中的表达关系。 结果 ECT2蛋白在乳腺癌和正常组织中的阳性表达率分别为55.6%和8.8%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);ECT2与P21蛋白表达在患者不同年龄、不同肿瘤大小及不同肿瘤类型间比较差异无统计学意义(P>0.05),而在不同肿瘤分级、淋巴结转移与否及不同TNM分期间比较差异有统计学意义(P<0.05)。ECT2和P21蛋白在乳腺癌中的表达呈显著负相关(r=-0.242,P<0.05)。 结论 ECT2和P21蛋白表达在乳腺癌的发生发展过程中均存在一定的作用,而且二者可能存在相互抑制作用。

乳腺癌; ECT2; P21

ECT2(epithelial cell transforming sequence 2)即上皮细胞转化序列2,是一种Rho家族中GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换因子,已经证实它与人类多种肿瘤的恶性表型有关[1]。P21蛋白为RAS抑癌基因编码的蛋白,P21拥有高度保守的结合域,能与GTP和GDP结合,当结合GTP时,P21处于活性状态,能够激活RAS下游的信号转导过程,从而调节细胞分化、增殖和凋亡过程[2]。有研究显示,通过下调ECT2的表达能够显著增强P21蛋白的表达,从而使细胞增殖停滞在G1期[3,4]。本研究应用免疫组化方法检测乳腺癌中ECT2和P21蛋白的表达情况,初步分析二者的表达关系,希望能够为乳腺癌的发生机制提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2012-2016年在山西医科大学第一医院病理科存档的乳腺癌根治标本133例及80例癌旁相应正常乳腺组织(标本均为相对应乳腺癌根治标本中远离癌组织的正常乳腺组织)。所有病例术前均未行放化疗,并已将资料不完整者排除(包括患者年龄、其他病史、放化疗史等不详的资料)。所有病例均进行复查,由2名资深的高级职称病理医师诊断,保证资料的准确性。

1.2 试剂与方法

免疫组化按EnVision二步法,实验步骤按试剂说明书进行。ECT2抗体购自Sigma公司,P21单克隆抗体、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。ECT2浓度配比1 ∶100,P21为工作液。PBS液代替一抗作阴性对照,用已知阳性切片作阳性对照。

1.3 结果判断

ECT2蛋白在肿瘤细胞核中表达,部分胞质有微弱表达,P21以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。评分标准:以染色强度和阳性细胞百分比判断,高倍镜(×400)下随机选取5个肿瘤细胞区域,每个视野计数50个细胞,计算平均值作为阳性百分率(阴性为0,1%-10%为1分,11%-50%为2分,51%-80%为3分,81%-100%为4分),染色强度按不显色、弱阳、中等阳及强阳分别记为0-3分,两者积分相乘:≤4分为低表达/不表达,>4分为高表达。

1.4 统计学分析

所有统计分析采用SPSS16.0统计软件实现,采用χ2检验及Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ECT2和P21蛋白在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达

ECT2和P21蛋白在乳腺癌中均高表达(见图1,2)。由表1可见,133例乳腺癌中ECT2阳性率为55.6%(74/133),与正常乳腺组织中阳性率8.8%(7/80)相比,差异有统计学意义(P<0.05);P21蛋白在乳腺癌中的阳性表达89例,阳性率为66.9%(89/133),正常乳腺组织10例,阳性率为12.5%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 ECT2在乳腺癌中高表达 (EnVision法，×100)Figure 1 High expression of ECT2 in breast cancer (EnVision，×100)

图2 P21在乳腺癌中高表达 (EnVision，×100)Figure 2 High expression of P21 in breast cancer (EnVision，×100)

表1ECT2和P21蛋白在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达

Table1TheexpressionofECT2andP21proteininbreastcancerandnormalbreasttissues

分组ECT2+-χ2PP21+-χ2P乳腺癌 745946.6020.000894459.4640.000正常乳腺7731070

2.2 ECT2和P21蛋白在乳腺癌中的表达与临床病理参数之间的关系

ECT2和P21蛋白表达在患者不同年龄、不同肿瘤大小及不同肿瘤类型间分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05),在肿瘤不同分级、淋巴结转移与否及不同TNM分期间比较,差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 乳腺癌中ECT2和P21蛋白之间的表达关系

133例乳腺癌中ECT2与P21蛋白共同阳性表达42例,二者表达差异有统计学意义(P<0.05,见表3),Pearson相关性分析显示,二者呈显著负相关(r=-0.242,P=0.005)。

3 讨论

乳腺癌诊断及治疗已经得到了较大的提高,但是有些乳腺癌却不能得到有效的治疗,尤其现在研究较为广泛的三阴乳腺癌,目前尚未发现有效的治疗措施。其最根本的原因是乳腺癌的发生发展机制尚未完全明了。上皮细胞转化序列2即ECT2在人类多种癌症中均有表达,它作为一种原癌基因,在多种癌症中频繁地表达上调,在肝细胞癌的研究中显示,ECT2表达明显上调,当应用siRNA敲除ECT2后,Rho GTP酶的活动受到了抑制,细胞凋亡增加,并且显著降低了肝癌细胞的转移能力,而ECT2高表达的病例细胞增殖活性强,患者生存期明显较低[5]。在结直肠癌中,ECT2表达显著高于正常组织,并且与肿瘤大小、CEA水平及TNM分期有关,生存分析显示ECT2高表达的患者生存期显著缩短,ECT2高表达是结直肠癌患者的独立预后因素[6]。在骨肉瘤的研究中显示,ECT2 mRNA的表达显著上调,并且与肿瘤高分级、复发转移及化疗反应差密切相关,而且ECT2的表达是患者总生存期和无病生存期独立的预后因素,ECT2表达上调是骨肉瘤患者预后不良的标志[7]。可见,ECT2不但在上皮性肿瘤中发挥作用而且在间叶源性肿瘤中同样有促进肿瘤生长的作用。我们的研究结果显示,ECT2在乳腺癌中的表达显著高于正常组织,而且与肿瘤分级、淋巴结转移及TNM分期密切相关,表明ECT2在乳腺癌的发生发展过程中均有一定的促进作用。

表2乳腺癌中ECT2和P21蛋白表达与临床指标之间的关系

Table2TherelationshipbetweenexpressionofECT2andP21proteinandclinicalparametersinbreastcancer

临床病理参数nECT2+-χ2PP21+-χ2P 年龄13374590.5150.49089441.3590.272 ≤49岁6333303924 >49岁7041295020 肿瘤大小0.1380.7292.3910.141 ≤2cm6135264516 >2cm7239334428 肿瘤类型0.2640.7081.5160.239 浸润性导管癌9152396427 浸润性小叶癌4222202517 分级7.1770.02813.9080.001 G15121304110 G24530153213 G33723141621 淋巴结转移34.4500.00013.0320.000 是423931923 否9135567021 TNM分期13.0010.00520.3700.000 Ⅰ期301218264 Ⅱ期342014295 Ⅲ期4533112322 Ⅳ期249151113

表3ECT2和P21蛋白表达在乳腺癌中的关系

Table3TherelationshipbetweenexpressionofECT2andP21proteininbreastcancer

P21ECT2+-χ2P+42477.7790.005-3212

P21为重要的抑癌基因,是迄今为止最为广泛的具有激酶活性的细胞周期抑制因子。P21在多条信号通路中发挥抑制肿瘤生长的作用,主要是负向调节细胞周期,使细胞分裂停止或处于相对静止期,并可导致细胞凋亡,这样肿瘤生长受到抑制,进展变缓[8]。P21在多种肿瘤中都有表达,而且其表达对肿瘤的生长都有一定的作用,如骨肉瘤中,P21蛋白的泛素化可以促进肿瘤生长,当抑制其泛素化后,细胞增殖停止,细胞被阻滞在S期[9];在大肠癌的研究中发现,激活并提高体内P21的表达,能够显著抑制细胞的生长[10];在鼻咽癌中,诱导P21在细胞中的表达,能够显著抑制细胞生长,促进凋亡[11],在这些研究均提示,P21可能是治疗肿瘤的潜在靶点。

P21在乳腺癌中已有研究报道,我们的研究结果显示P21在乳腺癌中表达增高,肿瘤分级高者阳性表达率相对低于分级低者,即G1病例阳性率高于G2、G3,呈递减趋势,淋巴结转移病例阳性率低于未转移病例,TNM分期高者阳性率同样低于分期低的病例,与文献报道相符[12]。而且,有研究发现P21在乳腺癌中的表达情况及对肿瘤的促凋亡作用与MAPK依赖的p21信号通路有关[13]。也有研究显示P21-p53通路在乳腺癌的发生发展过程中起了重要的作用,并且已经发现吴茱萸碱能够对该通路起到一定的抑制作用,从而抑制乳腺癌细胞的生长[14]。在口腔鳞状细胞癌的研究中发现,利用短发夹RNA抑制ECT2的表达后,细胞增殖显著受到抑制,细胞分裂停滞在G1期,并且细胞周期蛋白激酶抑制剂P21、P27显著上调,细胞凋亡增加[4]。本研究结果显示,ECT2与P21存在显著负相关性,也就是说二者在乳腺癌中所起的作用可能是相反的,提示ECT2和P21在乳腺癌的生长过程中可能同样存在一定的相互抑制作用。到目前为止,ECT2是否与P21在某些通路上发生了作用,还不是很清楚,需要在细胞水平进行研究,由于P21在多条信号通路上均有一定的作用,因此ECT2在乳腺癌中的作用,需要通过细胞周期相关分子从多条信号通路进行探索,下一步我们将从细胞角度进行研究,希望能够找到ECT2在乳腺癌中的作用机制。

[1] Tan H, Wang X, Yang X,etal.Oncogenic role of epithelial cell transforming sequence 2 in lung adenocarcinoma cells[J].Exp Ther Med,2016,12(4):2088-2094.

[2] Georgakilas AG, Martin OA, Bonner WM.p21:A two-faced genome guardian[J].Trends Mol Med,2017,23(4):310-319.

[3] Xu J1, Yao Q, Hou Y,etal.MiR-223/Ect2/p21 signaling regulates osteosarcoma cell cycle progression and proliferation[J].Biomed Pharmacother, 2013,67(5):381-386.

[4] Iyoda M1, Kasamatsu A, Ishigami T,etal.Epithelial cell transforming sequence 2 in human oral cancer[J].PLoS One, 2010,5(11):e14082.

[5] Chen J, Xia H, Zhang X,etal.ECT2 regulates the Rho/ERK signalling axis to promote early recurrence in human hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2015,62(6):1287-1295.

[6] Luo Y, Qin SL, Mu YF,etal.Elevated expression of ECT2 predicts unfavorable prognosis in patients with colorectal cancer[J].Biomed Pharmacother, 2015,73:135-139.

[7] Zhang H, Yin Z, Ning K,etal.Prognostic value of microRNA-223/epithelial cell transforming sequence 2 signaling in patients with osteosarcoma[J].Hum Pathol, 2014,45(7):1430-1436.

[8] Wang LL, Guo HH, Zhan Y,etal.Specific up-regulation of p21 by a small active RNA sequence suppresses human colorectal cancer growth[J].Oncotarget, 2017,8(15):25055-25065.

[9] Chen Z, Wang K, Hou C,etal.CRL4BDCAF11 E3 ligase targets p21 for degradation to control cell cycle progression in human osteosarcoma cells[J].Sci Rep, 2017,7(1):1175.

[10] Wang LL, Guo HH, Zhan Y,etal.Specific up-regulation of p21 by a small active RNA sequence suppresses human colorectal cancer growth[J].Oncotarget, 2017,8(15):25055-25065.

[11] Jiang X, Liu W.Long noncoding RNA highly upregulated in liver cancer activates p53-p21 pathway and promotes nasopharyngeal carcinoma cell growth[J].DNA Cell Biol, 2017, 36(7):596-602.

[12] Parsa Y, Mirmalek SA, Kani FE,etal.A review of the clinical implications of breast cancer biology[J].Electron Physician, 2016,8(5):2416-2424.

[13] Wang LH, Jiang XR, Chen GL,etal.Anti-tumor activity of SL4 against breast cancer cells: induction of G2/M arrest through modulation of the MAPK-dependent p21 signaling pathway[J].Sci Rep, 2016,6:36486.

[14] Han S, Woo JK, Jung Y,etal.Evodiamine selectively targets cancer stem-like cells through the p53-p21-Rb pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,469(4):1153-1158.

ExpressionofECT2andP21proteininbreastcanceranditsclinicalsignificance

WANG Hongkun,ZHENG Huixia*,LIANG Jianfang,XIAO Hong

(DepartmentofPathology,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;*Correspondingauthor,E-mail:huixiazheng62@126.com)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of ECT2 and P21 proteins in breast cancer.MethodsExpression of ECT2 and P21 proteins was detected in 133 cases of breast cancer tissues and 80 cases of normal breast tissues using EnVision immunohistochemistry.ResultsThe positive expression rates of ECT2 protein were 55.6% and 8.8% in breast cancer and normal breast tissues, respectively, and there was significant difference between the two groups(P<0.05). The positive expression rates of P21 proteins were 66.9% and 12.5% in breast cancer and normal breast tissues, respectively, and there was significant difference between the two groups(P<0.05).The expression of ECT2 and P21 protein was not correlated with age, tumor size, tumor type(P>0.05), but correlated with tumor grade, lymphatic metastasis and TNM staging(P<0.05). ECT2 expression was negatively correlated with P21 expression in breast cancer(r=-0.242，P<0.05).ConclusionThe expression of ECT2 and P21 protein may play a role in the development of breast cancer, and inhibit each other.

breast cancer; epithelial cell transforming sequence 2; P21

R737.9

A

1007-6611(2017)10-1057-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.017

王宏坤,男,1979-10生,硕士,主治医师,E-mail:whk2005002@163.com

2017-06-30