kshv-mir-k12-1-5p相关基因在卡波西肉瘤中的表达

张 静,吴秀娟,普雄明*

(1新疆医科大学附属中医医院病理科,乌鲁木齐 830000;2新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科;*通讯作者,E-mail:puxiongming@126.com)

kshv-mir-k12-1-5p相关基因在卡波西肉瘤中的表达

张 静1,吴秀娟2,普雄明2*

(1新疆医科大学附属中医医院病理科,乌鲁木齐 830000;2新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科;*通讯作者,E-mail:puxiongming@126.com)

目的 探索kshv-mir-k12-1-5p相关基因在卡波西肉瘤(KS)组织中的表达意义。 方法 通过在线miRNA靶基因软件Mirbase、Miranda和Targetscan寻找kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。通过GO和KEGG分析靶基因的信号通路及通路上的关键基因。使用免疫组化的方法检测靶基因、关键基因(kshv-mir-k12-1-5p相关基因)在卡波西肉瘤组织的表达。 结果 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因为CDKN1A,CDKN1A信号通路为Cell cycle通路,通路下游关键基因为CyclinD1、CyclinE。CDKN1A、CyclinD1、Cyclin E在肿瘤组织与瘤旁组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05),CDKN1A在卡波西肉瘤中的阳性表达率低于瘤旁组织(P<0.05),CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的阳性表达率高于瘤旁组织(P<0.05);在KS中CyclinD1与年龄相关(P<0.05),CyclinE与民族相关(P<0.05);在KS中CDKN1A与CyclinD1、CyclinE均呈负相关(P<0.05)。CyclinD1与CyclinE呈正相关(P<0.05)。 结论 kshv-mir-k12-1-5p的相关基因:CDKN1A、CyclinD1、CyclinE表达异常在KS发生、发展中具有重要的作用。

卡波西肉瘤; kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

卡波西肉瘤(Kaposis sarcoma, KS)是血管瘤样结构、梭形细胞增生的恶性肿瘤[1],临床有4种分型:经典型、非洲型、艾滋病病毒(AIDS)相关型及免疫抑制型。其中经典型及艾滋病病毒相关型在我国新疆地区报告较多,主要见于维吾尔族、哈萨克族等少数民族。卡波西肉瘤相关病毒(KSHV)是KS发生的必需因素和主要因素。KSHV通过编码的miRNA调控宿主的生存环境、宿主细胞的细胞周期和沉默靶基因等诸多途径影响感染细胞的分化状态,进而影响宿主细胞的细胞周期,从而促进KSHV诱导KS发生。在既往的研究中,通过对KS miRNA差异表达谱的筛选和验证得出在KS中kshv-mir-k12-1-5p表达明显上调[2]。本文从病因上研究与kshv-mir-k12-1-5p相关基因在KS的表达,为研究kshv-mir-k12-1-5p对KS的调控作用做基础。

1 材料与方法

1.1 病例来源

收集新疆医科大学附属中医医院及乌鲁木齐市友谊医院病理科卡波西肉瘤患者肿瘤和瘤旁组织40对石蜡组织,使用免疫组化方法对石蜡组织进行检测。

1.2 主要试剂

试剂来源:购自福州迈新有限公司免疫组化一抗:CDKN1A(细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂1A)、CyclinD1(细胞周期蛋白D1)、CyclinE(细胞周期蛋白E)。

1.3 确定靶基因

通过在线miRNA靶基因软件Mirbase,Miranda和Targetscan确定kshv-mir-k12-1-5p靶基因。Mirbase、Miranda、Targetscan网址如下:Mirbase: http://www.mirbase.org/,Miranda: http://www.microrna.org/microrna/home.do/,Targetscan: http://www.targetscan.org/vert-60/。

1.4 分析信号通路及关键基因

通过 GO 和 KEGG 分析靶基因的通路及通路上的关键基因。GO:http://www.geneontology.org,KEGG:http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html。

1.5 免疫组化检测

使用免疫组化方法检测石蜡组织中kshv-mir-k12-1-5p的相关基因:靶基因(CDKN1A)、信号通路关键基因(CyclinD1、CyclinE)的表达情况并分析其与临床参数的关系。

1.6 结果判断

每张切片随机选取10个高倍视野(40×10倍),每个视野500-1 000 个细胞。从以下两方面对切片进行计分: ① 染色强度: 0 分为无着色,1 分为淡黄色,2 分为棕黄色,3 分为棕褐色; ② 阳性细胞数: 1 分为1%-10%,2 分为 11%-50%,3 分为 51%-75%,4 分为≥76%。将两项评分相乘得出最终结果，阴性(-): < 3 分,阳性(+):≥3 分。CDKN1A、CyclinD1为肿瘤梭形细胞核阳性着色。CyclinE为肿瘤梭形细胞核/细胞浆阳性着色。高年资病理医师进行结果判定。

1.7 统计学分析

应用SPSS20.0统计软件对数据进行统计学分析,计数资料的差异性及相关性采用卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因

通过靶基因软件确定CDKN1A基因为kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。

2.2 kshv-mir-k12-1-5p的信号通路及通路上关键基因

通过GO和KEGG分析得出kshv-mir-k12-1-5p及靶基因CDKN1A参与Cell cycle信号通路,CyclinD1、CyclinE为通路下游的关键基因。

2.3 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤与瘤旁组织中的表达

卡波西肉瘤与瘤旁组织中CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的表达情况见图1。CDKN1A在卡波西肉瘤的阳性表达率(30.0%)明显低于瘤旁组织中的阳性表达率(75.0%),差异具有统计学意义(P<0.05);CyclinD1在卡波西肉瘤的阳性表达率(80.0%)明显高于瘤旁组织中的阳性表达率(40.0%),差异具有统计学意义(P<0.05);CyclinE在卡波西肉瘤的阳性表达率明显高于瘤旁组织中的阳性表达率,差异具有统计学意义(82.5%vs37.5%，P<0.05，见表1)。

表1CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤及瘤旁组织中的表达

Table1ExpressionofCDKN1A，CyclinD1，CyclinEinKSandadjacenttissue

类型nCDKN1ACyclinD1CyclinE+χ2P+χ2P+χ2P肿瘤4012(30.0)16.240.0032(80.0)13.330.0033(82.5)16.880.00瘤旁4030(75.0)16(40.0)15(37.5)

2.4 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE与卡波西肉瘤临床参数的关系分析

分析CDKN1A、CyclinD1、CyclinE与患者性别、发病年龄、民族、临床类型的关系。CyclinD1与年龄有关(P<0.05),CyclinE与民族有关(P<0.05,见表2)。

A. CyclinD1在肿瘤细胞核阳性表达;B. CDKN1A在肿瘤细胞核阳性表达;C. CyclinE在肿瘤细胞核阳性表达; D. CyclinD1在瘤旁组织阴性表达;E. CDKN1A在瘤旁组织细胞核阳性表达;F. CyclinE在瘤旁组织阴性表达图1 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中免疫组化染色 (40×10)Figure 1 Expression of CDKN1A,CyclinD1,CyclinE in KS by immunohistochemistry (40×10)

表2CDKN1A、CyclinD1、CyclinE同卡波西肉瘤临床参数的关系

Table2TherelationshipsofCDKN1A,CyclinD1,CyclinEwiththeclinicalfeaturesofKS

因素nCDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P+-χ2P 性别1.090.300.001.000.620.43 男35926287305 女5324132 年龄0.050.835.010.030.020.965 >4526719242224 ≤45145986113 民族0.001.000.360.554.180.04 维族351025296314 其他5233223 临床类型0.001.001.230.271.230.27 CKS4133122 AIDS-KS361125297315

2.5 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的相关性分析

在KS中CDKN1A与CyclinD1、CyclinE均呈负相关(P<0.05,见表3)。CyclinD1与CyclinE呈正相关(P<0.05,见表4)。

表3卡波西肉瘤中CDKN1A与CyclinD1、CyclinE的相关性

Table3ThecorrelationwithCDKN1AandCyclinD1,CyclinEinKS

CDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P阳性667.150.007754.750.029阴性262262

表4卡波西肉瘤中CyclinD1与CyclinE的相关性

Table4ThecorrelationwithCyclinD1andCyclinEinKS

CyclinECyclinD1+-χ2P阳性2934.770.029阴性44

3 讨论

卡波西肉瘤相关病毒(KSHV,即人疱疹病毒8型)[2]首先从AIDS相关型KS患者的肉瘤组织中发现。随后,在各型的KS中均发现了KSHV的高表达。KSHV与KS的发生关系密切。KSHV致瘤过程主要发生在病毒感染的潜伏期[3]。

本文通过在线miRNA靶基因软件确定kshv-mir-k12-1-5p的靶基因CDKN1A。通过GO和KEGG分析kshv-mir-k12-1-5p和靶基因的信号通路为Cell cycle信号通路及通路下游的关键基因CyclinD1、CyclinE。因此，CDKN1A、CyclinD1、CyclinE为kshv-mir-k12-1-5p的相关基因,共同参与细胞周期的调控。

细胞周期异常调控导致细胞异常增殖,是肿瘤发生的基础。细胞周期(cell cycle)信号通路中的关键基因CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的异常表达和卡波西肉瘤的发生密不可分。CyclinE和CyclinDl是细胞周期G1/S转换的正性重要调控因子。表达上调使G1/S转换时间变短,促进了细胞周期进程,细胞增殖过度,最终细胞癌变。本实验中CyclinD1、CyclinE在KS中高表达。卡波西肉瘤组明显高于对照组。CDKN1的生物学功能是抑制细胞生长、DNA复制;调控发育、分化等过程,与肿瘤的发生发展密切相关。本实验中CDKN1A阳性表达率在卡波西肉瘤组明显低于对照组。因为CDKN1A是一种罕见突变的抑癌基因,它在KS发展过程中,逐渐失去对细胞增殖的抑制作用,其蛋白水平降低参与KS的发生发展。本实验在KS中CyclinD1与年龄相关(P<0.05);CyclinE与民族相关(P<0.05);CDKN1A与CyclinD1、CyclinE均呈负相关;CyclinD1与CyclinE呈正相关。正常情况下CDKN1A的表达对停滞增长起重要作用。CDKN1A表达上调可抑制CDK的活性,抑制CyclinD1-CDK4/6复合物及CyclinE-CDK2复合物活性,使蛋白表达下调;表达受抑。细胞不能进入S期,导致细胞周期停滞。研究证实CyclinD1、CyclinE在多种肿瘤中出现过度表达[10]。两者具有协同作用,和本实验结论相似。因为在肿瘤的进展中,CDKN1A表达下调,对CyclinD1、CyclinE的抑制减弱,导致CyclinD1、CyclinE表达失控。

本研究为kshv-mir-k12-1-5p通过信号通路调控靶基因及关键基因的研究做基础,接下来将构建kshv-mir-k12-1-5pmimic、kshv-mir-k12-1-5p inhibitor等,转染到卡波西肉瘤细胞株中,研究过表达或低表达kshv-mir-k12-1-5p后,采用qRT-PCR及WB检测信号通路靶基因、关键基因(CDKN1A、CyclinD1、CyclinE)的mRNA和蛋白表达情况,明确kshv-mir-k12-1-5p对信号通路主要的调控作用，确定kshv-mir-k12-1-5p能否作为一个药物靶标。因此，先行检测在未调控下CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在KS中的表达,了解其表达的意义。

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Expressionofkshv-mir-k12-1-5p-relatedgeneinKaposi’ssarcoma

ZHANG Jing1，WU Xiujuan2，PU Xiongming2*

(1DepartmentofPathology,AffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofDermatology,People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion;*Correspondingauthor,E-mail:puxiongming@126.com)

ObjectiveTo explore the expression of kshv-mir-k12-1-5p-related gene in Kaposi’s sarcoma (KS) and its significance.MethodsThe kshv-mir-k12-1-5p target gene was detected through Mirbase, Miranda and Targetscan of the online miRNA target gene software. GO and KEGG were used to analyze signaling pathway and key gene in the pathway of the target gene. The expression of target gene and key gene(kshv-mir-k12-1-5p-related gene) was detected in Kaposi’s sarcoma by immunohistochemistry.ResultsThe target gene of kshv-mir-k12-1-5p was CDKN1A, CDKN1A signaling pathway was the cell cycle pathway, and the downstream key genes were CyclinD1 and CyclinE. Positive expression rate of CDKN1A in KS was lower in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05). Positive expression rates of CyclinD1,CyclinE in KS were higher in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05).Expression of CyclinD1 in KS was associated with age(P<0.05). Expression of CyclinE in KS was associated with nation(P<0.05). There was a negative correlation between the expression of CDKN1A and CyclinD1,CyclinE in KS(P<0.05).There was a positive correlation between the expression of CyclinD1 and CyclinE in KS(P<0.05).ConclusionThe expression of kshv-mir-k12-1-5p-related genes CDKN1A, CyclinD1, and CyclinE may play an important role in the occurrence and development of KS.

Kaposis sarcoma； kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

R739.5

A

1007-6611(2017)10-1044-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.014

国家自然科学基金资助项目(81660454);新疆医科大学附属中医医院院级课题(ZYY201702)

张静,女,1979-12生,在读博士,主治医师

2017-07-10