丹参酮IIA对成年大鼠睾丸扭转的保护作用和机制研究

张晓文，李建华，徐赫，孙思，杨瑜，朱伟东，陈明

(1.东南大学附属中大医院 泌尿外科， 江苏 南京 210009；2.青岛大学附属医院 急诊科， 山东 青岛 266000)

·论著·

丹参酮IIA对成年大鼠睾丸扭转的保护作用和机制研究

张晓文1，李建华2，徐赫1，孙思1，杨瑜1，朱伟东1，陈明1

(1.东南大学附属中大医院 泌尿外科， 江苏 南京 210009；2.青岛大学附属医院 急诊科， 山东 青岛 266000)

目的观察丹参酮IIA对成年大鼠睾丸扭转复位睾丸损伤的保护作用并初步探讨其机制。方法对建立左侧睾丸扭转复位动物模型，将36只7周龄健康SD雄性大鼠随机分为3组：假手术组、生理盐水组、丹参酮IIA组，每组12只；分别于术后72小时、4周两批处死大鼠，每批每组6只，取左侧睾丸，行HE染色及组织损伤评分，Tunel染色，以及睾丸组织内Bcl- 2蛋白检测(免疫印迹法)，检测总活性氧(ROS)，超氧化物歧化酶(SOD)、与丙二醛(MDA)含量，并测定大鼠血清睾酮水平。结果与生理盐水组比较，丹参酮II给药组在术后72小时睾丸组织损伤明显减轻，细胞凋亡减少，Bcl- 2表达升高；在术后4周发现给药组SOD、大鼠血清睾酮水平明显上升，而组织内ROS和MDA水平含量下降, 差异均具有显著性(P<0.05)。结论单次腹腔内注射丹参酮IIA对成年大鼠单侧睾丸扭转损伤具有保护作用，其机制在早期可能是通过抗凋亡作用，而在远期则可能发挥了抗氧化作用。

睾丸扭转； 丹参酮IIA； 氧化应激；凋亡； Bcl- 2；

睾丸扭转(testicular torsion，TT)是一种主要发生在儿童和年轻成年男性人群中的男科急症。由于精索扭转引起睾丸血管蒂的扭曲，导致静脉回流受阻，进而动脉血流闭塞，最终引发睾丸缺血[1]。睾丸缺血后4～8 小时后会引发不可逆的损伤[2]，因而一旦发现TT，应当立即行急诊手术复位。然而由于诊断及治疗不及时，有部分TT患者术后出现睾丸功能不全，严重影响了患者的生活质量，因此除了手术治疗外，寻找新型药物以减轻TT损伤非常有必要[3]。

天然草药中存在许多有用的化学物质，目前已经证明许多具有治疗价值的天然药物提取物并用于临床治疗。丹参酮IIA(tanshinone IIA)是从中草药丹参中提取的关键活性单体[4]。已经有研究表明，丹参酮IIA对脑缺血再灌注损伤和肾脏缺血再灌注损伤都具有保护[4，5]，保护机制可能涉及B细胞淋巴瘤- 2(Bcl- 2)，Bcl- 2相关X蛋白(Bax)和TRPM7调控[6,7]以及氧自由基的清除，然而，目前对于丹参酮IIA是否可以保护TT损伤目前尚无相关研究，因此，在本研究中，我们建立了成年大鼠单侧TT模型，并观察丹参酮IIA治疗TT的作用，并且初步探讨其潜在机制，以期为治疗TT损伤的新型药物开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验动物选取6周龄的健康雄性SD 大鼠36只，体质量180～200 g，购自东南大学动物实验中心。

1.2 试剂

丹参酮IIA购自美国Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、睾酮检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DCFHDA试剂盒购自美国Sigma公司；TUNEL检测试剂盒购自美国罗氏生物公司；Bcl- 2以及β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，ECL发光试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 动物模型处理及取材

大鼠随机分为假手术组(Sham)、生理盐水治疗组(Saline)、丹参酮IIA治疗组(Tansh)，每组12 只。大鼠术前用10%水合氯醛(0.8 ml·kg-1)行腹腔注射。麻醉起效后，假手术组将左侧阴囊打开，分离暴露左侧睾丸后即给予固定缝合。两实验组依Turner 法建立双侧TT模型[8]：左阴囊小切口，游离睾丸并切断睾丸引带，分离周围组织，睾丸顺时针扭转720度，固定睾丸防止自然复位，维持4 h后经原切口打开，扭转复位组复位扭转睾丸并固定后关闭切口；盐水治疗组在复位30 min后腹腔注射0.9% NaCl溶液1 ml；丹参酮治疗组在复位30 min后腹腔注射0.9% NaCl溶液1 ml的丹参酮IIA(25 mg·kg-1)[5]；分别于术后72 h，4周处死大鼠，取大鼠左侧睾丸以及血清检测。

1.4 睾丸损伤形态学变化和细胞凋亡检测

睾丸切下后称重，固定于10%的甲醛溶液中，然后常规石蜡切片、HE染色，光镜下观察睾丸损伤情况，行组织学损伤评分；组织切片应用TUNEL染色(RCHO公司，美国)，荧光显微镜下观察凋亡细胞，并计数。

1.5 睾丸组织内氧化应激水平测定

新鲜睾丸组织，冰上匀浆后，分别按照试剂盒说明书采用MDA检测试剂盒，SOD检测试剂盒，DCFHDA法检测睾丸组织中MDA水平，SOD水平以及活性氧(ROS)水平。

1.6 Bcl- 2蛋白的Westernblot测定

新鲜睾丸组织，冰上匀浆后，使用单去污裂解液提取细胞总蛋白；煮沸后上样至SDS- 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，低温电转至PVDF膜，封闭；分别以1∶500和1∶1 000 稀释的Bcl- 2或β- actin抗体(美国Santa Cruz公司)为一抗进行杂交2 h，洗膜后加入1∶3 000稀释的二抗杂交2 h；化学发光法检测杂交信号；以Bcl- 2灰度值与β-actin灰度值的比值作为Bcl- 2蛋白相对表达。

1.7 大鼠血清睾酮水平测定

大鼠处死前经腹主动脉取血并离心取血清，参照试剂盒操作步骤，通过放射免疫法平行测定各组大鼠血清中睾酮含量。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 应用丹参酮IIA大鼠睾丸复位早期减轻组织损伤

如图1所示，在大鼠睾丸复位72 h，通过HE染色在光镜下观察，可见假手术组生精上皮均紧贴精细小管生长，排列紧密，有序；生理盐水组睾丸组织内精细小管结构不连续，损伤明显，管腔内有大量渗出；生精上皮层排列紊乱，仅基底层较明显，其余生精上皮层或缺失，或脱落，且见毛玻璃样改变；丹参酮治疗组，睾丸组织损伤明显减轻。组织学评分，各组间有统计学差异(P<0.05)。

A.HE染色切片(光镜下200×)；B. 组织学损伤评分(*P<0.05，vsTansh)；(Sham，假手术组； Saline，生理盐水组；Tansh，丹参酮治疗组)

图1大鼠睾丸大鼠睾丸组织HE染色及组织学评分

2.2 丹参酮IIA治疗后，睾丸组织细胞凋亡明显减少，同时Bcl- 2表达上调

如图2所示，在大鼠睾丸复位72 h，生理盐水组睾丸组织内细胞凋亡细胞较假手术组明显增多，而经丹参酮IIA处理后，细胞凋亡明显减少，差异具有统计学差异(P<0.05)。通过Westernblot检测，发现丹参酮IIA可以上调Bcl- 2蛋白表达水平(P<0.05)。

2.3 睾丸扭转复位后晚期，丹参酮IIA治疗可以提高大鼠睾酮水平，降低氧化应激水平

如图3所示，在睾丸复位后4周，可见生理盐水组大鼠血清睾酮水平较假手术组明显降低，而经丹参酮IIA治疗后，睾酮水平明显上升，差异具有显著性(P<0.05)。而通过睾丸组织内MDA，SOD以及ROS检测，发现丹参酮IIA明显降低了睾丸组织内氧化应激的水平，差异均具有显著性(P<0.05)。

3 讨 论

睾丸扭转复位是一典型的缺血再灌注过程，在这一过程中可产生大量的活性氧(ROS)，如超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮和次氯酸等，这些活性氧攻击正常的细胞，引起膜脂质过氧化，大分子蛋白功能失活以及核酸损伤，进而引起组织细胞的死亡[9]。另外，睾丸组织部分缺血坏死后，周边尚未坏死的组织在低氧刺激下启动凋亡程序，进一步加重组织细胞的死亡[9]。Leydig细胞是生成雄性激素的主要细胞来源，对ROS的损伤十分敏感[10]，睾丸扭转后的高氧化应激水平可以直接损伤Leydig细胞，导致其坏死或凋亡，这也是严重睾丸扭转后患者远期低睾酮的重要原因之一。而如何减轻急性期的睾丸损伤以及在远期提高患者生活质量成为临床的一个重要研究方向。

A.大鼠睾丸组织Tunel染色切片(荧光显微镜下400×)； B. 睾丸组织凋亡细胞计数(*P<0.05，vsTansh)；C. 大鼠睾丸组织Bcl- 2表达情况； (Sham，假手术组； Saline，生理盐水组；Tansh，丹参酮治疗组)

图2大鼠睾丸组织细胞凋亡及Bcl-2表达情况

A.大鼠血清睾酮水平；B. 大鼠睾丸组织活性氧(ROS)水平；C. 大鼠睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)水平； D.大鼠睾丸组织丙二醛(MDA)水平；(*P<0.05，vsTansh；#P<0.05，vsSham；Sham，假手术组； Saline，生理盐水组；Tansh，丹参酮治疗组)

图3大鼠血清睾酮水平以及睾丸组织氧化应激水平

在祖国医学中，很多天然草药被用来治疗疾病。例如，来自青蒿的青蒿素被广泛使用治疗疟疾[11]，这一发现在2015年获得了诺贝尔医学奖。这提示我们可以从中草药中寻找具有生物活性的化学单体。丹参酮IIA是从中草药丹参中提取的关键活性单体[4]。已经有研究表明，丹参酮IIA对脑缺血再灌注损伤和肾脏缺血再灌注损伤都具有保护[4，5]， 保护机制可能涉及B细胞淋巴瘤- 2(Bcl- 2)，Bcl- 2相关X蛋白(Bax)和TRPM7调控[6，7]以及氧自由基的清除。在本研究中，我们发现应用丹参酮IIA后，睾丸组织的组织学损伤明显减轻，同时我们发现，睾丸组织的细胞凋亡明显减少；这说明丹参酮IIA可能通过抗凋亡作用在急性期对睾丸扭转有保护作用； Bcl- 2是一种重要的抗细胞凋亡基因，尤其是在缺血再灌注损伤中起到突出作用[12]。另外，有研究还表明，Bcl- 2同时可以具有间接的抗氧化作用，它可以抑制超氧阴离子的产生，而不是直接去除活性氧[12]，也有研究表明Bcl- 2抑制超氧阴离子生成可能与抑制细胞色素C释放有关[13]。通过对Bcl- 2的检测，我们发现丹参酮IIA可以上调Bcl- 2蛋白的表达，因此，我们推测丹参酮IIA可能是通过上调Bcl- 2从而起到了抗凋亡作用。

在睾丸扭转复位后4周，我们检测了大鼠的睾酮水平，发现相比较于生理盐水组，丹参酮IIA可以升高睾酮水平(P<0.05)，但与假手术组比较，仍有差异(P<0.05)。说明在远期，丹参酮IIA可以提高睾丸的内分泌功能。同时，通过观察睾丸组织中MDA水平，ROS以及SOD等氧化应激指标，我们还发现，丹参酮IIA降低了扭转后远期睾丸组织内氧化应激的水平。如前所述，Leydig细胞是生成睾酮的重要细胞，在睾丸扭转中受到活性氧的攻击后死亡是引起远期雄激素水平下降的原因。我们的结果表明，丹参酮IIA在远期可能是通过抗氧化作用减轻了睾丸组织中氧化应激水平进而提高了睾酮水平。鉴于Bcl- 2的间接抗氧化作用，我们推测丹参酮IIA在睾丸扭转中的抗氧化作用很可能与上调Bcl- 2有关。

在本研究中，我们观察到丹参酮IIA在早期通过抗凋亡作用减轻了睾丸组织的损伤，同时丹参酮IIA也具有抗氧化作用，其抗凋亡抗氧化作用可能与其上调Bcl- 2有关；然而关于丹参酮IIA抗氧化及抗凋亡的具体机制目前尚不清楚，我们将在下一步研究中继续探索。总之，丹参酮IIA是一种具有保护作用的化学单体，我们的研究为其将来应用于睾丸扭转的临床治疗提供了初步的科学依据。

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ThemechanismresearchforProtectiveeffectoftanshinoneⅡAontesticulartorsioninadultrats

ZHANGXiao-wen1，LIJian-hua2，XUHe1，SUNSi1，YANGYu1，ZHUWei-dong1，CHENMing1

(1.DepartmentofUrology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China；2.DepartmentofEmegency，QingdaoUniversityAffiliatedHospital,Qingdao266000,China)

Objective: To observe the protective effect of tanshinone IIA on testicular torsion and return to testicular injury in adult rats and to explore its mechanism.Methods36 male SD rats aged 7 weeks were randomly divided into 3 groups: sham operation group, saline group and tanshinone IIA group, 12 rats in each group. The rats were sacrificed at 72 hours and 4 weeks after operation. Six rats in each group and left testes were subjected to HE staining and histological injury score, Tunel staining, and Bcl- 2 protein test (immunoblotting), reactive oxygen (ROS), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were measured. Serum testosterone levels were measured as well.ResultsCompared with the saline group, the testis tissue injury was significantly reduced in the tanshinone IIA group, the apoptotic cells were decreased and the expression of Bcl- 2 was increased. The levels of SOD and the level of serum testosterone in rats was significantly higher than that in saline group (P<0.05).ConclusionSingle intraperitoneal injection of tanshinone II has protective effect on unilateral testicular torsion injury in adult rats, possibly through the anti- apoptotic effect in early stage, and may play an antioxidant role in the long term.

testicular torsion; tanshinone ⅡA; oxidative stress; apoptosis; Bcl- 2

2017- 03- 05

2017- 09- 11

国家自然科学基金面上项目(81670632)

张晓文(1975-)，男，江苏常州人，博士，主治医师，擅长泌尿外科各种微创手术，主要从事肿瘤免疫治疗的相关研究。E- mail: zhangxiaowen75@hotmail.com

陈明 E- mail: chenmingseu@126.com

张晓文，李建华，徐赫，等. 丹参酮IIA对成年大鼠睾丸扭转的保护作用和机制研究[J].东南大学学报：医学版，2017,36(5):795- 799.

R697+.2

A

1671- 6264(2017)05- 0795- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.023

(本文编辑：孙茂民)