利拉鲁肽激活Akt通路改善乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

张文娟，周雪，李瑞雪，杨茜，夏丽芳，李志红

(保定市第一中心医院 内分泌二科，河北 保定 071000 )

·论著·

利拉鲁肽激活Akt通路改善乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

张文娟，周雪，李瑞雪，杨茜，夏丽芳，李志红

(保定市第一中心医院 内分泌二科，河北 保定 071000 )

目的研究利拉鲁肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响及机制。方法分离乳鼠心肌细胞,分为对照组、缺氧/复氧组和利拉鲁肽组，体外构建缺氧/复氧损伤模型，使用流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot检测凋亡相关蛋白caspase- 3、Akt以及Akt磷酸化水平。结果对乳鼠心肌细胞进行缺氧/复氧损伤处理后，流式细胞术检测发现，与对照组相比，缺氧/复氧损伤能明显诱导细胞凋亡，而利拉鲁肽则有抗凋亡作用；Western blot结果提示，缺氧/复氧损伤可诱导caspase- 3表达，激活凋亡相关信号通路，促进细胞凋亡，而利拉鲁肽组细胞Akt磷酸化水平明显增加， caspase- 3表达减少、活性降低。结论利拉鲁肽可以通过增加Akt磷酸化以激活Akt通路，抑制caspase- 3的表达，发挥抗凋亡作用，改善缺氧/复氧损伤。

利拉鲁肽； 缺氧/复氧损伤； Akt通路； 细胞凋亡； 乳鼠

心肌缺血再灌注损伤是指在阻断冠脉血流一段时间以后，在恢复供血供氧的情况下，心肌进一步发生损伤和坏死，其甚至可能是造成缺血后心肌损伤的主要原因之一[1]。缺血再灌注损伤发生的机制包括恢复血供后过量自由基的产生、细胞内钙超载、微血管损伤等[2]。因此如何保护缺血后心肌细胞免受再次损伤是临床治疗缺血性心脏病面临的重要问题。肠促胰素胰升糖素样肽- 1(glucagon- like peptide- 1，GLP- 1) 是前甘露醇前体N- 衍生肽家族的一员，基础和临床研究均表明GLP- 1可以发挥心血管保护作用[3]。GLP- 1受体在心脏中有表达[4]，GLP- 1受体激动剂能直接激活心肌细胞信号通路[5]。利拉鲁肽是GLP- 1类似物，为GLP- 1受体激动剂，可以减小心梗大鼠动物模型的心梗面积，改善心功能[6]；滕晓焕等[7]通过建立大鼠缺血再灌注损伤模型也发现，利拉鲁肽可抑制心肌凋亡从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。但是对于利拉鲁肽在其中的作用并不十分明确，本实验拟通过分离乳鼠心肌细胞建立缺氧/复氧模型，并用利拉鲁肽进行处理，探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，一抗Akt、p- Akt、caspase- 3(Cell Signaling Technology)，相应二抗(Abcam),胰蛋白酶(Sigma公司)，Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)，利拉鲁肽(诺和诺德公司)，流式细胞仪(Beckman Coulter)。

1.2 乳鼠心肌细胞分离及鉴定

参照文献记录的方法分离心肌细胞[8]。选取出生1～3d的SD乳鼠，无菌操作迅速取出心室，放入预冷的D- Hanks液中，然后将心室剪成1mm3左右的组织块,并用0.2%的胰蛋白酶消化，直至心肌组织块消失。用消化终止液终止消化，1000 r·min-1离心15 min 沉淀细胞，用全培液重悬沉淀的细胞后接种于细胞培养皿，于CO2孵箱、37 ℃培养。采用心肌细胞α- actin 免疫荧光染色鉴定心肌细胞。

1.3 缺氧/复氧损伤模型制备

采用Koyama的方法配制缺氧液和复氧液[9]。缺氧液预先用高浓度氮气1 L·min-1饱和30 min，用此培养基培养心肌细胞，然后放入充有高纯度氮气的密封袋，于常规培养箱(5%CO2、95%O2)培养为缺氧;复氧液用纯氧1L·min-1饱和30min，然后用于培养心肌细胞，于常规培养箱中进行培养，此为复氧。

1.4 实验分组

取培养72 h的心肌细胞进行实验，分为3组。对照组：使用复氧液在常规培养箱中培养4 h；缺氧/复氧组：缺氧条件培养3 h后复氧条件培养1 h；利拉鲁肽组：在缺氧液和复氧液中加入终浓度为100 mmol的利拉鲁肽，缺氧条件培养3 h后复氧条件培养1 h。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

实验结束后， 用0.05%不含EDTA的胰酶消化细胞，2 000 r·min-1离心5 min,弃上清液，PBS 洗涤2次，收集细胞，使用500 μl Binding buffer重悬细胞，加入Annexin V- FITC后混匀，加入碘化丙啶(PI)，室温、避光反应10～20 min，1 h内上机检测。

1.6 Western blot检测Akt通路相关蛋白的表达

将收集的各组心肌细胞加入裂解液，置于冰上然后于摇床上摇动15 min，4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，取上清。测定蛋白浓度，加入2×SDS上样缓冲液和去离子水调整蛋白浓度，样品100 ℃煮沸5 min，80 μg·孔-1蛋白上样、电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后再用HRP标记的相应二抗室温孵育1 h。然后ECL发光液发光，拍照，用凝胶图象处理系统分析目的条带光密度值。

1.7 统计学处理

统计分析采用 SPSS 18.0软件，计量资料以均数±标准差表示，多组之间比较采用单因素方差分析(one- way ANOVA)，采用LSD法对组与组间进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳鼠心肌细胞的培养及鉴定

乳鼠心肌细胞种于玻片上，用alpha- actinin抗体进行免疫荧光染色后鉴定，alpha- actinin阳性的细胞是心肌细胞，阴性的为成纤维细胞(图1)。

2.2 利拉鲁肽对缺氧/复氧引起的细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，其中对照组细胞凋亡水平非常低[(1.0±0.3)%]，缺氧/复氧处理明显增加细胞凋亡水平[(59.2±6.5)%]，在培养基中加入利拉鲁肽可明显抑制缺氧/复氧损伤引起的细胞凋亡[(32.7±3.5)%]。见图2。

A.alpha- actinin免疫荧光染色;B.Hothest染细胞核;C.merge图

图1乳鼠心肌细胞

其中Q3象限表示存货细胞，Q2为晚期凋亡细胞，Q4为早期凋亡细胞，计算细胞凋亡率时为Q3+Q4的和

图2流式细胞术检测细胞凋亡

2.3 心肌细胞Akt通路及相关蛋白的表达

收集实验处理后的细胞，使用Western blot检测相关蛋白的表达。caspase- 3是参与细胞凋亡的重要蛋白，我们的研究发现，与对照组细胞相比，缺氧/复氧组细胞caspase- 3的表达和剪切明显增加，而利拉鲁肽则能抑制caspase- 3的表达。Akt是caspase- 3的上游蛋白，具有抗凋亡作用，与对照组和缺氧/复氧组相比，利拉鲁肽能上调Akt的表达并增加其磷酸化，从而减少caspase- 3的剪切，发挥抗凋亡作用。见图3。

3 讨 论

缺血再灌注损伤是心梗后患者心肌发生梗死的重要机制，其发生包括氧自由基的产生、细胞内钙超载等。GLP- 1是一种由肠腔远端L型细胞分泌的具有降血糖作用的激素。目前有关GLP- 1的研究多集中在其调节血糖方面，其可降低2型糖尿病患者血糖[10]。然而近几年发现GLP- 1受体在心脏中也有表达，因此其对心血管系统的保护作用越来越受到关注[11]。利拉鲁肽是GLP- 1的类似物，可与GLP- 1受体结合，激活其下游通路。Shiraki等[12]研究发现利拉鲁肽可浓度依赖性地减少氧自由基的产生，因此其可能有助于抑制缺血再灌注损伤的发生，能够减小心肌梗死后心肌损伤面积，减少细胞凋亡。

与对照组相比,aP<0.05;与缺氧/复氧组相比,aP<0.05

A.Western blot结果图；B、C.灰度值统计图

图3Westernblot检测利拉鲁肽对Akt通路及相关蛋白的激活

本研究采用分离乳鼠心肌细胞的方法，在体外构建缺氧/复氧模型模拟在体情况下的心肌缺血再灌注损伤，探索利拉鲁肽在抗缺血再灌注损伤中的作用机制。我们发现，缺氧/复氧能明显增加心肌细胞的凋亡，而利拉鲁肽则能对抗缺氧/复氧诱导的凋亡的发生。细胞凋亡是一种细胞的程序性死亡，受细胞自身相关信号通路的调节，其中caspase- 3是参与细胞凋亡的重要分子。在一定条件刺激下，caspase- 3发生剪切，产生活性参与细胞凋亡[13]。本研究中，与对照组相比，缺氧/复氧组细胞caspase- 3表达和剪切明显增加，与流式细胞结果相似，而利拉鲁肽能减少caspase- 3的表达和剪切，从而抑制凋亡。研究发现，在心梗后的大鼠中，利拉鲁肽能增加Akt的磷酸化，Akt处于caspase- 3的上游，能调节caspase- 3活性发挥抗凋亡作用。

我们的研究也证实，利拉鲁肽组细胞Akt磷酸化明显增加，因而利拉鲁肽可能通过激活Akt通路减少caspase- 3的表达，从而抑制细胞凋亡，发挥抗缺氧/复氧损伤作用。细胞凋亡的信号通路十分复杂，Akt是重要的抗凋亡分子，抑制Akt活性可导致细胞凋亡。而某些因素可以促进Akt活性，抑制caspase- 3激活，从而发挥抗凋亡作用[14]。

综上所述，缺氧复氧损伤可以激活caspase- 3，从而诱导细胞凋亡的产生。而利拉鲁肽可以通过增加Akt磷酸化以激活Akt通路，抑制caspase- 3的表达，发挥抗凋亡作用，改善缺氧/复氧损伤。

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LiraglutideactivatestheAktpathwaytoimprovemyocardialcellsofneonatalratswithhypoxia/reoxygenationinjury

ZHANGWen-juan,ZHOUXue,LIRui-xue,YANGQian,XIALi-fang,LIZhi-hong

(DepartmentofEndocrine,BaodingFirstCentralHospital,Baoding071000,China)

Objective: To study the effects of liraglutide on hypoxia/reoxygenation injury in neonatal rat cardiomyocytes and the underlying mechanism.MethodsThe cardiomyocytes were isolated from neonatal rats, and then divided into control group, hypoxia / reoxygenation group and liraglutide group. The model of hypoxia / reoxygenation injury was establishedinvitro. Apoptosis was detected by flow cytometry and apoptosis related proteins including caspase- 3, Akt, and phospho- Akt were detected by Western blot.ResultsCardiomyocytes of neonatal rats were treated with hypoxia / reoxygenation injury, compared with the control group, results of flow cytometry showed that hypoxia / reoxygenation injury could induce apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes, while liraglutide had anti- apoptosis effects. Western blot showed that the expression of caspase- 3 was activated by the hypoxia / reoxygenation injury. While in the liraglutide group, the phosphorylation of Akt was increased, as a result, the expression and activation of caspase- 3 was suppressed.ConlusionLiraglutide could improve the hypoxia/reoxygenation injury by increasing Akt phosphorylation to activate the Akt pathway, suppress the expression of caspase- 3, and harbour an anti- apoptotic effect.

liraglutide; hypoxia/reoxygenation injury; Akt pathway; apoptosis; neonatal rats

2017- 02- 15

2017- 06- 30

保定市科学技术研究与发展指导计划项目(16ZF110)

张文娟(1983-)，女，河北高阳人，主治医师。E- mail：2283153844@qq.com

李志红 E- mail：Lizhihonglfz@126.com

张文娟，周雪，李瑞雪，等. 利拉鲁肽激活Akt通路改善乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤[J].东南大学学报:医学版,2017,36(5)：764- 768.

R542.22;R33- 33

A

1671- 6264(2017)05- 0764- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.016

(本文编辑：何彦梅)