丹皮酚抑制PM2.5诱导的人支气管上皮细胞VEGF表达的研究

翁晓芹 杜强 冯旰珠 黄茂

丹皮酚抑制PM2.5诱导的人支气管上皮细胞VEGF表达的研究

翁晓芹1杜强2冯旰珠2黄茂1

目的观察丹皮酚对细颗粒物(particulate matter 2.5, PM2.5)诱导的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)表达血管内皮生长因子(vascular endothelia growth factor, VEGF)的影响。方法选取不同浓度PM2.5 (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL)刺激BEAS-2B细胞，分别收集刺激6 h、12 h、24 h 后的细胞培养上清液和刺激24 h后的细胞，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western Blot方法检测上清液中及细胞内VEGF的表达水平；利用不同浓度丹皮酚(15μmol/L, 30μmol/L)进行干预24 h，收集细胞培养上清液，采用ELISA方法检测上清液中VEGF的表达水平。结果随着PM2.5浓度的升高，细胞培养上清及支气管上皮细胞中VEGF蛋白表达水平呈剂量依赖性增高；随着PM2.5作用时间的延长，细胞培养上清中VEGF的表达水平呈时间依赖性增高；丹皮酚干预可抑制PM2.5诱导的VEGF表达，且抑制效应呈剂量依赖性。结论PM2.5可诱导BEAS-2B表达VEGF，该作用可以被丹皮酚抑制。

丹皮酚；PM2.5；血管内皮生长因子

细颗粒物(Particulate Matter2.5, PM2.5)是指大气总悬浮颗粒物中空气动力学效应直径≤2.5 μm的颗粒物，为大气颗粒物的主要组成部分，主要来源于汽车尾气和燃煤[1]；PM2.5颗粒直径小，可经由呼吸道到达远端肺损伤支气管和肺泡，PM2.5长期刺激可诱发支气管哮喘、肺炎、慢性支气管炎、肺癌、间质性肺病等呼吸系统疾病[2]。谢鹏等[3]研究表明，随着PM2.5浓度的增加，人群中呼吸系统疾病死亡率明显增加，每升高10 μg/m3，死亡率增加1.43%。近年来，PM2.5污染已成为我国第四大死亡原因[4]。

血管内皮生长因子(vascular endothelia growth factor, VEGF)是呼吸系统损伤反应中重要炎症介质之一，近年来多项研究表明其具有促进炎性细胞趋化、聚集、血管生成、气道重塑等功能，在气道炎症性疾病尤其在哮喘的发生发展中具有重要作用[5-6]。

丹皮酚(Paeonol)又称芍药醇,主要为中药牡丹皮中酚类化合物，具有抗炎、免疫调节、抗氧化等多种作用[7-9]，但有关其抑制气道炎症的作用报道较少。

资料与方法

一、 材料

支气管上皮细胞(BEAS-2B) 购自美国ATCC公司；DMEM高糖培养购自Hyclone公司； ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司；抗VEGF 抗体购自美国SantaCruz公司；丹皮酚(纯度>98%)购自南京泽朗医药科技有限公司。

二、方法

1 BEAS-2B细胞的培养：于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中接种BEAS-2B细胞，于5% CO2、37 ℃条件下培养至细胞融合80%，然后用PBS溶液洗涤两次，加入0.25%胰酶消化，以2×105个/mL细胞密度接种于六孔板。

2 PM2.5的采集与制备：采样点位于南京市鼓楼区，采用武汉天虹 TH-150 中流量总悬浮微粒采样器，在空气质量指数大于5级及PM2.5严重超标的雾霾天采样，将采样纤维滤膜经超声洗脱处理后离心20min，收集提取物真空冷冻干燥成干粉，称重，于-20℃避光保存备用。使用时用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)配置成质量浓度分别为0、25、50、100ug/mL的PM2.5混悬液[10]。

3 PM2.5刺激：当BEAS-2B细胞以对数生长，融合达80%时，以无血清培养基继续培养6 h，然后利用不同剂量的PM2.5刺激细胞。实验分为：① 对照组，培养基中PM2.5 含量为0 μg/mL；② 刺激组：培养基中加入PM2.5，使其终浓度分别为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，刺激6 h、12 h、24 h后，收集细胞培养上清，利用ELISA测定上清中VEGF蛋白水平；提取细胞全蛋白，利用Western Blot方法检测细胞中VEGF蛋白水平。

4 丹皮酚干预：BEAS-2B在不同浓度PM2.5 (25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)刺激的同时，利用不同浓度丹皮酚(15μmol/L、30μmol/L)进行干预，药物干预下孵育24 h后，收集细胞培养上清，使用ELISA试剂盒检测上清中VEGF蛋白水平。

三、 统计学处理

结 果

一、 PM2.5对BEAS-2B表达VEGF的影响

给予不同浓度PM2.5刺激BEAS-2B细胞24 h后，对细胞培养上清及细胞中VEGF蛋白表达水平进行检测。结果提示，随着PM2.5浓度的升高，细胞培养上清中VEGF水平呈浓度依赖性逐渐增加，p值分别为0.001、0.0252、0.0381，差别存在统计学意义(图1A)。利用Western Blot方法对BEAS-2B细胞中VEGF蛋白表达水平进行检测，结果显示： BEAS-2B细胞中VEGF蛋白表达随着不同浓度的PM2.5刺激呈浓度依赖性逐步提高， P值分别为0.0279、0.0004、0.0043，差别有统计学意义(图1B，1C)。

图1A不同浓度PM2.5刺激后BEAS-2B细胞培养上清中VEGF的蛋白表达水平图1B不同浓度PM2.5刺激后BEAS-2B细胞VEGF的蛋白表达水平图1C不同浓度PM2.5刺激后BEAS-2B细胞中VEGF的蛋白表达水平

在同一浓度下，利用PM2.5分别刺激细胞6 h、12 h、24 h，随PM2.5作用时间延长，细胞培养上清中VEGF蛋白表达水平逐步上升。如图2所示，PM2.5浓度为25 μg/mL时，P值分别为0.001、<0.001；PM2.5浓度为50 μg/mL是，P值分别为<0.001、0.003；PM2.5浓度为100 μg/mL组P值分别为<0.001、<0.001，差别均存在统计学意义。

图2 不同浓度PM2.5作用不同时间诱导VEGF表达水平变化

与作用时间6 h 组相比，#P<0.05； 与作用时间12 h 组相比：*P<0.05

二、 丹皮酚干预后对VEGF表达的影响

BEAS-2B细胞在PM2.5 (25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL )各种浓度刺激下，分别利用不同浓度丹皮酚(15 μg/mL、30 μg/mL)进行干预24 h，用ELISA检测细胞培养上清液中VEGF表达水平。(见图3)所示，丹皮酚对基础状态下VEGF的表达无抑制作用，但可以抑制各个浓度PM2.5诱导的VEGF表达上调。对照组 BEAS-2B 细胞随着丹皮酚(15μmol/L、30μmol/L )浓度变化，VEGF水平无显著变化(P值分别为0.093、0.087 )；在PM2.5浓度分别为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL时，15μmol/L丹皮酚即可抑制细胞VEGF的表达(P值分别为<0.001、0.008、<0.001)；30μmol/L丹皮酚与15μmol/L丹皮酚相比，可进一步抑制VEGF表达水平(P值分别为<0.001、<0.001、0.015 )，差别有统计学意义。

图3 不同浓度的丹皮酚对BEAS-2B细胞VEGF表达的影响

讨 论

PM2.5主要来源为煤炭燃烧、机动车尾气、烟草烟雾等，其化学成分主要包括多环芳香烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs )类以及铁、锌等金属元素，目前关于PM2.5的研究较多，既往研究表明，PM2.5可通过招募炎症细胞、释放细胞因子和活性氧(ROS)，进而激活不同的路径,如促细胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶,核转录因子κB(NF-κB),信号转导与转录激活子-1(Stat-1)等参与呼吸系统疾病如哮喘、慢阻肺、肺纤维化,甚至肺癌的发生[11]。刘莎莎[12]、徐秀段[13]等曾研究表明PM2.5可通过活化NF-ΚB、转录因子激活蛋白1(AP-1)进而调控多种炎性因子(如IL-8、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、VEGF)表达，诱导气道炎症反应。

VEGF广泛分布于肺组织中，在炎症、血管新生和调节上皮层通透性中均发挥重要作用。近年来血管因素在慢阻肺及哮喘所致的气道重塑中受到越来越多的关注，哮喘主要表现为血管生成和血管渗漏同时慢阻肺主要表现为血管舒张和血管渗漏。[14]VEGF在哮喘及慢阻肺中是一种血管生长的关键调节器，如哮喘气道中VEGF可以促进气道内皮细胞的增殖、分化和诱导血管渗漏，同时可以调节Th2细胞反应进而趋化单核细胞和嗜酸粒细胞聚集并导致气道水肿[15]。

本课题组在既往研究中已发现，PM2.5可加重哮喘小鼠的气道炎症[16]，为进一步探索PM2.5参与哮喘气道炎症的分子机制，本实验对PM2.5干预后的支气管上皮细胞内的VEGF的变化进行研究，研究发现PM2.5能够呈浓度及时间依赖性增加支气管上皮细胞对VEGF的表达，该结果提示PM2.5 可能通过上调VEGF导致呼吸系统损伤进而诱导哮喘的加重。其机制可能为 PM2.5激活气道上皮细胞内的NF-κB、PA-1等，进而上调VEGF的表达[12-13]。

目前全球每年有320万人的死亡归因于PM2.5污染，严重增加全球的疾病负担[17]；Wagner等[18]研究证实，暴露于PM2.5会导致氧化应激、气道炎症和气道高反应性，控制因PM2.5所致的气道损伤可进一步减少呼吸系统疾病尤其是哮喘的发作具有重要意义。丹皮酚是从牡丹花根皮中提取出来的一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、镇静、止痛、抗肿瘤等多种生物学效应[19]。目前已有应用以丹皮酚为主要成分的药物治疗皮肤和关节炎症的报道，有研究证实丹皮酚可通过调节IL-8等细胞因子减轻气道炎症[10]。本实验使用丹皮酚干预PM2.5刺激后的BEAS-2B细胞发现：丹皮酚能显著抑制PM2.5诱导气道上皮细胞分泌VEGF，且抑制作用呈随着丹皮酚浓度的增加而加强。

综上所述，PM2.5可通过上调气道内VEGF的表达导致气道炎症加重，而丹皮酚能通过抑制VEGF表达减轻气道炎症，可为进一步开发新药物对抗因PM2.5引起的气道炎症如哮喘、慢阻肺急性加重等提供一定的实验依据，但仍需体内实验进一步验证，其具体分子机制尚需进一步深入研究。

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InhibitoryeffectofpaeonolontheexpressionofVEGFinbronchialepithelialcellsinducedbyPM2.5

WENGXiao-qin,DUQiang,FENGGan-zhu,HUANGMao

DepartmentofRespiratoryMedicine,thefirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China

ObjectiveTo explore the effect of peaonol on the expression of vascular endothelia growth factor (VEGF) in human epithelia cell (BEAS-2B) stimulated with particulate matter 2.5 (PM2.5).MethodsBEAS-2B cells were stimulated with PM2.5 (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL), the cell culture supernatants were collected after 6 h, 12 h and 24 h and cells were obtained after 24 h. VEGF in supernatants and cells were detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western Blot respectively. BEAS-2B cells stimulated with PM2.5 (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) were treated with peaonol (15μmol/L, 30μmol/L) for 24 h in vitro. After treatment, the cell culture supernatants were collected and VEGF in the supernatants were estimated by ELISA.ResultsPM2.5 enhanced the protein expression of VEGF in supernatants and BEAS-2B cells in a dose dependent way and increased its expression in supernatants in a time dependent way. Peaonal could inhibit PM2.5-induced VEGF expression in a dose dependent way.ConclusionPM2.5 could up-regulate the expression of VEGF in BEAS-2B, which could be suppressed by peaonol.

Paeonol; PM2.5; vascular endothelia growth factor

2017-04-23]

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