猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株和变异株主要免疫原性基因分析

杨 涛，张丹英，赵 冉，陈 琼

（厦门市动物疫病预防控制中心，厦门361009）

·简报·

猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株和变异株主要免疫原性基因分析

杨 涛，张丹英，赵 冉，陈 琼

（厦门市动物疫病预防控制中心，厦门361009）

自2011年底以来，我国多个省份暴发了猪伪狂犬病，一些研究院所证实当前猪伪狂犬病毒流行株发生了一定程度的变异，疫苗不能提供完全的保护。为了在分子生物学水平上比较不同厂家猪伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株，以及与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株，在主要免疫原性蛋白之间的差异，选取了4个厂家的活疫苗Bartha-K61株，通过二代测序方法进行测序，对Bartha-K61株gB、gC和gD这3种主要免疫原性基因以及推导出的氨基酸序列与变异株之间进行同源性分析。结果显示，Bartha-K61疫苗株与变异株gB蛋白序列中有23处特征性的差异，同源性为96.3%～96.9%；gC蛋白序列中有25处特征性的差异，同源性为92.7%～93.1%；gD蛋白序列中有10处特征性的差异，同源性为96.8%～97.3%；以gB、gC和gD氨基酸序列建立的进化分析结果显示，Bartha-K61疫苗株与变异株分属两个不同进化分支。

猪伪狂犬病；Bartha-K61株；免疫原性基因

Abstract:Swine pseudorabies has occurred in many provinces in China since the end of 2011 and PRV variant strains have been con fi rmed as the causative agents. In addition, some reports showed that the currently used vaccines did not provide complete protection.In the present study, the homology of gB, gC and gD genes and their deduced amino acid sequences of pseudorabies Bartha-K61 vaccine strain and variant strains were analyzed in order to compare the differences in these genes coding for major immunogenic proteins. As a result, the protein sequences of Bartha-K61 vaccine strains and variant strains was 96.3% ～ 96.9% identical but 23 differences in gB,92.7% ～ 93.1% identical but 25 differences in gC and 96.8% ～ 97.3% identical but 10 differences in gD, respectively. Phylogenetic analysis of deduced amino acid sequences of gB, gC and gD genes showed that Bartha-K61 vaccine strains and variant PRV strains belonged to two different evolutionary branches.

Key words:Pseudorabies; Bartha-K61 strain; immunogenic gene

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属，可以感染多种家畜及野生动物，对养猪业危害极大。PRV病毒基因组为线性双链DNA分子，基因组大小约143 kb，平均G+C含量可高达74%，具有典型的疱疹病毒基因组结构特征，由独特长区段（UL）、独特短区段（US）以及位于US两侧的末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）组成，共包含有超过70个开放阅读框，可编码70～100种病毒蛋白，目前已发现和命名的糖蛋白有11种，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM 和gN，其中gB、gC和gD是PRV主要的免疫原性蛋白。2011年以来，我国许多地方暴发了以母猪流产、死胎、仔猪神经症状并导致大量死亡为主要特征的伪狂犬病，许多使用Bartha-K61弱毒株疫苗的规模化猪场也相继出现了PR，随后国内多个研究院所分离到病毒，并且证实为PRV变异株[1-3]。一些学者对PRV变异株研究分析后，认为原因可能有2个[4]：一是现在流行的毒株发生变异，并存在免疫逃逸现象；二是现在流行的PRV毒株毒力变强，与经典毒株相比，一些毒力基因发生了多位点的缺失或突变，如变异株gE蛋白均存在天冬氨酸的插入[5]，并推测可能导致病毒毒力发生变化，从而导致免疫失败。

疫苗注射是防制猪伪狂犬病的主要手段，尤其是基因缺失弱毒疫苗，专家认为当前流行株发生了一定程度的变异，目前的疫苗虽然不能提供完全的保护，但对变异毒还是有一定的交叉保护性，Bartha-K61株等现有疫苗依然能够防御PRV变异株[6]。毒株、抗原含量和试用结果这3项指标是衡量疫苗是否有效的关键指标，同一毒株经过不同代次的增值，核酸会发生一定的变异，导致疫苗的免疫效果也会不同。目前生产Bartha-K61株活疫苗的厂家共有41个，其中国产37个，进口厂家4个。为了在分子生物学水平上研究不同厂家活疫苗Bartha-K61株之间，以及与当前流行的PRV变异株之间的免疫原性基因及其蛋白之间同源性，本研究选取了4个厂家的Bartha-K61株活疫苗，通过二代测序方法进行DNA全基因组测序，对Bartha-K61株gB、gC和gD这3种主要免疫原性基因及其推导出的氨基酸序列和变异株之间进行同源性分析，为猪伪狂犬病的有效防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 疫苗株从本地猪场收集到4个厂家生产的Bartha-K61弱毒株疫苗，其中国产3个，分别命名为ZM（Lot：1508006-2）、AL（Lot：20150901）和HSY（Lot：2014003），进口1个，命名为BLG（Lot：195-C13），且都在有效使用期内。

1.2 主要试剂和仪器基因组DNA提取试剂盒购自AB公司，PCR预混液试剂购自天根公司；核酸提取仪和磁力架为AB公司生产，用Qubit 2.0定量DNA 浓度，Agilent Bioanalyzer 2100检测文库DNA片段大小和定量，二代测序仪为illumina公司Mesiq测序仪。

1.3 PCR鉴定参照童武等[7]设计的引物，扩增gB基因，引物由上海英潍捷基公司合成，扩增长度为633 bp。P1：5'- CCAGTCCCAGGCCACCGTGAA GTG -3'；P2：5'- ATCGCCGTGCTCTTCAAGGA GAAC -3'。按照DNA提取试剂盒说明书，用磁珠法提取4株Bartha-K61疫苗株的基因组DNA作为PCR模板，扩增gB基因，反应体系：引物P1/P2各1 uL，模板1 uL，2×Mix液12.5 uL，补ddH2O至25 uL；反应条件：95℃ 预变性5 min，94℃变性 1 min、68℃延伸 1 min、72℃退火 1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。反应结束后取5 uL PCR产物于1%TAE琼脂糖凝胶中电泳检测。

1.4 基因组序列测定文库构建采用illumina公司的Nextera XT试剂盒，首先用Qubit进行DNA浓度定量，Nextera XT构建文库只需1 ng DNA，通过转座子酶切、PCR扩增、定量酶切片段和PCR产物纯化后，检测文库DNA片段大小，并再次用Qubit定量文库DNA浓度，各自稀释到4 nmol/mL进行混合，测序试剂盒为V2，双端测序，读长150 bp，上样浓度控制在8～9 pmol/uL，上样量为600 uL。测序结果委托专业生物技术公司进行拼接组装。

1.5 序列分析采用DNAStar软件，将4个Bartha-K61疫苗株的gB、gC和gD基因以及推导出的氨基酸序列，与GenBank中的2012年及以后分离的12株PRV变异株和匈牙利的Bartha株的相应序列进行同源性比对分析，参考毒株见表1。再用MEGA 6.06中的邻接法（neighbour-joining；bootstrap values of 1000 replicates）对gB、gC和gD蛋白进行遗传进化分析。

表1 参考的毒株Table 1 Referenced PRV strains in GenBank

2 结果与讨论

2.1 PCR产物电泳检测对4个 Bartha-K61弱毒疫苗株进行DNA提取，经PCR扩增后，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，均观察到1条长度为633 bp的特异条带，大小与预期相符（图1）。

图1 PRV gB蛋白基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR ampli fi cation of the PRV gB

2.2 DNA测序结果测序结果显示，由于PRV基因组本身GC偏向严重，加上文库DNA片段长度波动太大，导致基因组末端序列的测序数据缺失严重，未能把4个 Bartha-K61弱毒疫苗株的全基因组序列组装完全。参照GenBank上变异株匈牙利Bartha株（GenBank登录号：JF797217）的基因组，除了HSY疫苗株有3个蛋白基因未能组装完整外（其中包括gC），其他3个疫苗株都成功组装了65个完整基因。分析结果显示，4个Bartha-K61疫苗株与匈牙利Bartha株gB、gC和gD氨基酸序列同源性高达99.7%，这反映了PRV基因组高度保守的特性。gB和gD在PRV复制和细胞融合过程中是必需的，gC虽不是病毒复制所必需的，但在对靶细胞的吸附和传播中的释放起着十分重要的作用，三者都是刺激机体产生中和抗体和病毒特异性的细胞免疫应答反应的主要免疫原性蛋白，在免疫应答反应中有着非常重要的作用，而4个Bartha-K61疫苗株与PRV变异株在这3种主要免疫原性蛋白序列上均有多处特征性的差异，其中与gC氨基酸序列同源性最低。

2.3 gB基因及氨基酸序列分析Bartha株PRVgB基因全长为2751 bp，编码916个氨基酸，而PRV变异株gB基因全长为2745 bp，编码914个氨基酸。变异株与Bartha株相比，gB基因在第224位开始连续有9个碱基的缺失，分别为GCCCCGGCC，而在270位开始连续有3个碱基的插入，分别为CGG。4个 Bartha-K61疫苗株与匈牙利Bartha株的gB基因同源性为99.9%～100%，12株PRV变异株之间的gB基因同源性为99.7%～100%，而Bartha-K61疫苗株与变异株的gB基因同源性为98.1%～98.4%。4个Bartha-K61疫苗株与JF797217-Bartha株的gB基因推导氨基酸序列同源性为99.7%～100%，与JF797217-Bartha株相比，ZM疫苗株在第14和15位由HR突变为QA，BLG、HSY和ZM株在第145位由Q氨基酸突变为R；12株PRV变异株之间的gB氨基酸序列同源性为99.3%～100%，而Bartha-K61疫苗株与变异株的gB氨基酸序列同源性为96.3%～96.9%。Bartha疫苗株与变异株gB蛋白序列中共有23处特征性的差异（表2），其进化分析结果表明，Bartha株与变异株位于2个不同的分支（图2）。现有研究结果表明，gB蛋白的优势抗原表位区分别在59～126、214～289、507～734位氨基酸处[8]，分析结果显示Bartha-K61疫苗株与变异株在gB蛋白的这些位置均存在差异。

2.4 gC基因及氨基酸序列分析Bartha株PRVgC基因全长为1443 bp，编码480个氨基酸，而PRV变异株gC基因全长为1464 bp，编码487个氨基酸。变异株与Bartha株相比，gC基因在第186位开始连续有21个碱基的插入，分别为GGCCGCGGCCTCCACGCCCGC。3个 Bartha-K61疫苗株与变异株匈牙利Bartha株的gC基因同源性为99.8%～100%，12株PRV变异株之间的gC基因同源性为99.7%～100%，而Bartha-K61疫苗株与变异株的gC基因同源性为95.8%～95.9%。3个Bartha-K61疫苗株与变异株匈牙利Bartha株的gC基因推导氨基酸序列同源性为99.4%～100%，12株PRV变异株之间的gC基因推导氨基酸序列同源性为99.4%～100%，而Bartha-K61疫苗株与变异株的gC基因推导氨基酸序列同源性为92.7%～93.1%。Bartha疫苗株与变异株gC蛋白序列中共有25处特征性的差异（表3），其进化分析结果表明，Bartha株与变异株位于2个不同的分支（图3）。范克伟等[9]对FJLY11株和Bartha疫苗株进行了gC蛋白抗原性及表面抗原位点进行了对比分析，认为FJLY11株和Bartha疫苗株gC蛋白抗原指数之间存在差异，发生了漂移，从而推测变异株正在向远离Bartha疫苗株的方向变异，导致Bartha疫苗不能提供完全的保护。

2.5 gD基因及氨基酸序列分析Bartha株PRVgD基因全长为1203 bp，编码400个氨基酸，而PRV变异株gD基因全长为1209 bp，编码402个氨基酸，其中变异株Fa株（GenBank登录号：KM189913）gD基因全长为1215 bp，编码404个氨基酸。变异株与Bartha株相比，gD基因在第826位开始连续有6个碱基的插入，分别为AGGCCC，变异株Fa株第826位开始连续有12个碱基的插入，分别为AGGCCCAGGCCC。4个 Bartha-K61疫苗株与JF797217-Bartha的gD基因同源性为99.8%～100%，12株PRV变异株之间的gD基因同源性为99.4%～100%，而Bartha-K61疫苗株与变异株的gD基因同源性为98.6%～98.9%。4个 Bartha-K61疫苗株与变异株的gD基因推导氨基酸序列同源性为99.5%～100%，12株PRV变异株之间的gD基因推导氨基酸序列同源性为99.5%～100%，而Bartha-K61疫苗株与变异株的gD基因推导氨基酸序列同源性为96.8%～97.3%。Bartha疫苗株与变异株gD蛋白序列中共有10处特征性的差异（表4），其中第277和278位gD蛋白插入RP，其进化分析结果也表明，Bartha株与变异株位于2个不同的分支（图4）。

表2 Bartha-K61疫苗株与PRV变异株gB蛋白序列中特征性差异位点Table 2 Characteristic differences in gB protein sequences between Bartha-K61 vaccine strains and PRV variant strains

图2 PRV gB基因推导的氨基酸遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on deduced amino acid of PRV gB gene

表3 Bartha-K61疫苗株与PRV变异株gC蛋白序列中特征性差异位点Table 3 Characteristic differences in gC protein sequences between Bartha-K61 vaccine strains and PRV variant strains

图3 PRV gC基因推导的氨基酸遗传进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on deduced amino acid of PRV gC gene

表4 Bartha-K61疫苗株与PRV变异株gD蛋白序列中特征性差异位点Table 4 Characteristic differences in gD protein sequences between Bartha-K61 vaccine strains and PRV variant strains

综上所述，以gB、gC和gD氨基酸序列分别建立的进化分析结果都表明Bartha-K61疫苗株与变异株分属两个不同进化分支。在免疫应答过程中，抗原表位（又称抗原决定簇，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团）是大分子复合物上可被免疫系统识别的部分，起着重要的作用，根据免疫应答过程中受体细胞的不同分为两大类-B细胞和T细胞，B细胞表位由抗体或B细胞受体识别，又分为线性表位和构象表位两种，线性表位由连续的氨基酸序列组成，构象表位存在于抗原分子的三维结构表面，在氨基酸序列上往往是不连续的，构象表位是B细胞主要的表位。Bartha-K61疫苗株与PRV变异株在gB、gC和gD蛋白序列的差异，是否引起B细胞线性表位和构象表位发生变化，从而导致PRV变异株突破Bartha-K61株疫苗免疫产生的抗体的保护，引起免疫逃逸，需要通过生物信息学工具对其B细胞表位进行更深入的预测分析和研究，并且要综合考虑预测工具的准确性，才能得出进一步的结论。

图4 PRVgD氨基酸遗传进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on deduced amino acid of PRV gD

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ANALYSIS OF MAJOR IMMUNOGENIC GENES OF PSEUDORABIES VIRUS BARTHA-K61 VACCINE AND VARIANT STRAINS

YANG Tao, ZHANG Dan-ying, ZHAO Ran, CHEN Qiong

(Xiamen Center for Animal Disease Control and Prevention, Xiamen 361009, China)

S852.659.1

B

1674-6422（2017）04-0050-06

2016-10-08

厦门市科技计划项目（3502Z20154095）

杨涛，女，硕士，副研究员，主要从事动物疫病监测与兽医流行病学研究

杨涛，E-mail：yangtao@china-fetpv.org