同型半胱氨酸对实验性结肠炎模型中COX-2及5-LOX表达的影响

王 晶，丁少桢，胡 翠，胡 静，刘晓昌，梅 俏，许建明

(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽 合肥 230022)

◇研究简报◇

同型半胱氨酸对实验性结肠炎模型中COX-2及5-LOX表达的影响

王 晶，丁少桢，胡 翠，胡 静，刘晓昌，梅 俏，许建明

(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽 合肥 230022)

梅 俏(1971-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：炎症性肠病，通讯作者，E-mail：meiqiao@hotmail.com

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含巯基氨基酸，是甲硫氨酸去甲基化过程中的产物，可通过多种途径促发炎症反应，启动由细胞免疫所介导的局部和全身慢性炎症。研究发现[1]，Hcy可激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，导致多种炎症基因转录，参与炎症的发生。炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，发病机制目前尚未完全明确。研究发现，IBD患者肠黏膜中，经由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)代谢合成白三烯(leukotrienes，LTs)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)代谢合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的量升高。肠黏膜发生炎症时，由COX-2合成的PGE2引发血管扩张、黏膜充血水肿及渗透性增加。5-LOX可以调节炎症细胞的迁移浸润，促进炎症介质产生，增加肠黏膜通透性[2]。在对关节炎大鼠模型研究中发现，抗关节炎药物通过抑制NF-κB信号通路，下调5-LOX和COX-2基因表达，导致LTB4和PGE2合成减少，减轻关节炎症[3]，提示5-LOX和COX-2受到NF-κB的调控。另外，我们发现IBD患者结肠黏膜中Hcy浓度明显升高[4]，且Hcy会进一步加重结肠炎症的病理损伤，但Hcy对IBD肠黏膜炎症损伤的具体机制尚不明确。因此，本研究拟建立高Hcy特征的实验性结肠炎大鼠模型，探讨Hcy是否通过促进NF-κB的表达，调控5-LOX、COX-2合成LTs和PGE2水平增加，加重结肠炎症。

1 材料

1.1实验动物与试剂SD大鼠，SPF级，♂，体质量(200±20)g，实验动物许可证号：34000200000480，由安徽省实验动物中心提供。三硝基苯磺酸(TNBS)、DL-Hcy均购于美国Sigma公司；LTs及PGE2试剂盒购于武汉新启迪生物科技公司。

1.2方法

1.2.1实验分组 大鼠分为4组，每组8只，在室温、光周期12 h ∶12 h条件下适应性饲养1周后使用。A组(正常对照组)：生理盐水灌肠+生理盐水皮下注射；B组(TNBS模型组)：TNBS/乙醇溶液灌肠+生理盐水皮下注射；C组(正常对照+Hcy注射组)：生理盐水灌肠+Hcy皮下注射；D组(TNBS模型+Hcy注射组)：TNBS/乙醇溶液灌肠+Hcy皮下注射。

1.2.2高Hcy血症模型的制备和给药方法 参照文献[5]，采用10%水合氯醛进行腹腔注射，经肛门将橡胶管插入大鼠结肠内，长度约8 cm，注入(1 ∶1)乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg-1)溶液。对照组灌肠等体积生理盐水。DL-Hcy溶解于生理盐水，滴定pH至7.4，参照文献剂量[6]，自TNBS模型制备后d 1起，皮下注射Hcy(0.03 μmol·kg-1)，每天2次，间隔8 h，连续30 d。对照组皮下注射等体积生理盐水。

1.2.3标本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切取远端结肠8 cm左右，沿纵轴剪开肠管，冰生理盐水冲洗干净后，取部分结肠进行检测。

1.2.4ELISA法检测大鼠结肠匀浆LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平 取病变结肠组织，制备成匀浆，采用ELISA双抗夹心法检测其中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)、PGE2的水平。

1.2.5RT-qPCR法检测结肠黏膜组织5-LOX、COX-2及NF-κB mRNA表达 提取结肠黏膜组织mRNA，取出基因组DNA，合成cDNA后，按照试剂盒说明书进行加样：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s退火，72℃延伸，40个循环。分析方法：relative quantification study，分析指标为：2-ΔΔCt。5-LOX引物序列：Forward primer: 5′-AGTTGCCTAAGAAGCTCCCA-3′； Reverse primer：5′-GCATCAATGCCATCCAGTAG -3′； 产物长度：133 bp。COX-2引物序列：Forward primer：5′-AATCGCTGTACAAGCAGTGG-3′；Reverse primer：5′-GCAGCCATTTCTTTCTCTCC-3′；产物长度：144 bp。NF-κB 引物序列：Forward primer：5′-GCCTCATCCACATGAACTTG-3′；Reverse primer：5′-CGCTTCTTCACACACTGGAT-3′；产物长度：120 bp。

Tab 1 Effects of Hcy on LTB4，LTC4，LTD4，LTE4 and PGE2 levels in colonic homogenate of experimental colitis rats(±s，n=8)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsTNBS/ethanol group

2 结果

2.1Hcy对结肠炎大鼠结肠匀浆中LTs和PGE2水平的影响如Tab 1所示，与正常对照组比较，TNBS模型组及正常对照组+Hcy注射组大鼠结肠匀浆中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平升高(P<0.05)。与TNBS模型组比较，TNBS模型+Hcy注射组大鼠结肠匀浆中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平明显升高(P<0.05)，提示Hcy引起肠道炎症介质水平的升高。

2.2Hcy对结肠炎大鼠结肠黏膜中5-LOX、COX-2及NF-κBmRNA表达的影响如Tab 2所示，与正常对照组相比，TNBS模型组大鼠结肠黏膜组织5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表达增加。与TNBS模型组相比，TNBS模型+Hcy注射组大鼠结肠黏膜组织5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表达明显增加(P<0.05)，提示Hcy可能通过调控NF-κB信号通路，促进5-LOX、COX-2的表达，加重肠道炎症的发生。

Tab 2 Effects of Hcy on mRNA expressionof 5-LOX, COX-2 and NF-κB in colonic mucosaof experimental colitis rats(±s，n=8)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsTNBS/ethanol

3 讨论

本研究通过制备大鼠高Hcy血症实验性结肠炎模型，发现与正常对照组比较，Hcy注射组和TNBS模型组两组大鼠结肠匀浆中的LTs和PGE2的水平均升高，大鼠结肠黏膜组织5-LOX、COX-2、NF-κB的mRNA表达升高，提示Hcy可能通过对COX-2、5-LOX、NF-κB mRNA表达的调节，引起LTs和PGE2的升高，促进肠道炎症损伤。因此，通过降低IBD患者体内Hcy水平，有助于减轻炎症损伤，但是Hcy调节COX-2、5-LOX及NF-κB途径的具体机制目前尚不明确，有待进一步的研究。

[1] Lazzerini P E, Selvi E, Lorenzini S, et al. Homocysteine enhances cytokine production in cultured synoviocytes from rheumatoid arthritis patients[J].ClinExpRheumatol, 2006,24(4): 387-93.

[2] Jupp J, Hillier K, Elliott D H, et al. Colonic expression of leukotriene-pathway enzymes in inflammatory bowel diseases[J].InflammBowelDis, 2007,13(5): 537-46.

[3] Zhang X, Ito Y, Liang J, et al. Therapeutic effects of total steroid saponin extracts from the rhizome of Dioscorea zingiberensis CH Wright in Freund′s complete adjuvant induced arthritis in rats[J].IntImmunopharmacol, 2014,23(2): 407-16.

[4] 丁少桢, 丁 浩, 梅 俏, 等. 同型半胱氨酸调控 MEK-ERK-MLCK 通路影响结肠炎大鼠肠黏膜通透性的实验研究[J]. 中国药理学通报, 2016,32(4): 498-502.

[4] Ding S Z, Ding H, Mei Q, et al. Effect of homocysteine on the intestinal permeability by regulating ERK-MLCK signal transduction in experimental colitis rats[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(4):498-502.

[5] Morris G P, Beck P L, Herridge M S, et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology, 1989,96(3): 795-803.

[6] Scherer E B S, da Cunha A A, Kolling J, et al. Development of an animal model for chronic mild hyperhomocysteinemia and its response to oxidative damage[J].IntJDevNeurosci, 2011,29(7): 693-9.

EffectsofhomocysteineonexpressionofCOX-2and5-LOXinexperimentalcolitsratmodel

WANG Jing, DING Shao-zhen, HU Cui, HU Jing, LIU Xiao-chang, MEI Qiao, XU Jian-ming

(DeptofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

同型半胱氨酸；炎症性肠病；环氧合酶-2；5-脂氧合酶；核转录因子-κB；白三烯；前列腺素E2

homocysteine; inflammatory bowel disease；cyclooxygenase-2；5-lipoxygenase；nuclear factor kappa B；leukotrienes；prostaglandin E2

A

1001-1978(2017)11-1627-02

R-332；R322.45；R363-332；R574.62；R977.4；R977.3；R977.6

时间：2017-10-10 10:05 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.058.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.029

2017-06-21，

2017-07-26

国家自然科学基金资助项目(No 81470809)

王 晶(1992-)，女，硕士生，研究方向：炎症性肠病，E-mial：1653198369@qq.com；