骨内单次注射辛伐他汀促进小鼠乳腺癌肿瘤血管正常化的研究

海 宝，刘 灿，张 稳，祝俊雄，曹宝山，宋纯理,2

(1.北京大学第三医院骨科，北京 100191；2.脊柱疾病研究北京市重点实验室，北京 100191；3.北京大学第三医院肿瘤化疗与放射病科，北京 100191)

研究报告

骨内单次注射辛伐他汀促进小鼠乳腺癌肿瘤血管正常化的研究

海 宝1，刘 灿1，张 稳1，祝俊雄1，曹宝山3，宋纯理1,2*

(1.北京大学第三医院骨科，北京 100191；2.脊柱疾病研究北京市重点实验室，北京 100191；3.北京大学第三医院肿瘤化疗与放射病科，北京 100191)

目的研究骨内单次注射辛伐他汀对小鼠乳腺癌肿瘤血管结构和功能的影响。方法构建小鼠乳腺癌原位模型，分别给予骨内单次注射辛伐他汀(50 μg)或空白载体。α-SMA/CD31免疫荧光双染观察肿瘤血管的周细胞/血管内皮细胞覆盖率；尾静脉注射伊文氏蓝染料观察肿瘤血管渗透性；免疫组化检测肿瘤内部HIF-1α表达水平的变化。结果免疫荧光双染发现与对照组相比辛伐他汀组肿瘤血管周细胞覆盖增多(P< 0.05)；肿瘤组织内伊文氏蓝含量显著降低(P< 0.05)，提示肿瘤血管渗透性减低，肿瘤血管趋于成熟；免疫组化显示肿瘤内部HIF-1α的表达水平降低，乳腺癌肿瘤组织缺氧改善。结论骨内单次注射辛伐他汀能够提高新生血管的周细胞覆盖，促进乳腺癌肿瘤血管正常化。

辛伐他汀；骨内注射；血管正常化；乳腺癌；周细胞

肿瘤的生长和转移依赖新血管的形成[1]，而新生的肿瘤血管往往结构异常并且杂乱无章，大约有50%的肿瘤血管都是无功能的，形成组织间隙压升高、局部低氧的肿瘤微环境[2]。有学者提出通过抗肿瘤血管新生以达到“饿死肿瘤”的目标，但目前此方面的研究并未取得应有的治疗效果，甚至因血管阻断药物造成局部缺氧，反而加速新血管生成和肿瘤生长[3]。近年来，肿瘤“血管正常化”作为一种新的治疗理念，被广泛研究[4,5]，合理应用抗血管生成药物可以使异常的肿瘤新生血管趋于正常化，通过与化疗药物结合治疗能够增强药效，但其治疗时间窗口很窄，难以广泛应用[6]。

近年来研究发现他汀类药物具有除降脂以外的“多效性”，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤等[7]。本课题组前期实验发现骨内单次注射辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝胶具有动员内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)促进局部成骨及成血管的作用[8]。新的观点认为，骨骼不仅是参与运动和支撑作用的惰性器官，而且是能够分泌多种活性物质的“内分泌器官”[9]，骨重建过程中，释放大量的促血管生成因子如VEGF、bFGF等影响系统血管新生[10]。骨髓内还储存着丰富的EPCs和周细胞等[11]，研究表明骨髓源性的造血干细胞能够分化为EPCs被动员至肿瘤参与血管的新生，而骨髓来源的周细胞也能够被募集至肿瘤促进血管的成熟[12]。

本实验通过骨内单次注射辛伐他汀水凝胶，观察其作用于骨髓内而产生的对远处肿瘤血管形态和功能的影响，为肿瘤的治疗提供新的策略。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠40只，6周龄，体重18～20 g，购买于北京大学医学部实验动物科学部[SCXK(京)2016-0010]，饲养于北京大学医学部实验动物科学部[SYXK(京)2016-0041]，实验动物单笼饲养，自由饮食，并按照实验动物使用的“3R”原则给予人道关怀，适应性喂养一周后开始实验。

1.1.2 细胞株

4T1小鼠乳腺癌细胞株由德国伯托公司惠赠。

1.2主要试剂与仪器

辛伐他汀原料药(中国药品生物制品检定所)；泊洛沙姆(德国BASF公司)；兔抗(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；抗CD31多克隆抗体(Abcam，美国)；抗α-SMA单克隆抗体(Abcam，美国)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)。

1.3实验方法

1.3.1 建立4T1乳腺癌细胞株小鼠移植瘤模型

取对数生长期的4T1小鼠乳腺癌细胞接种于小鼠乳腺脂肪垫。监测小鼠的一般情况、体重、饮食及排便状况，使用游标卡尺隔日记录小鼠皮下肿块体积。以肿瘤最长直径(a)和垂直最短径(b)计算肿瘤体积分数：公式V(mm3)= ab2/2(V为肿瘤近似体积)[13]。

1.3.2 泊洛沙姆水凝胶配制

泊洛沙姆407的配制按照本实验室既往方法[14]，将辛伐他汀粉末加入配制好的泊洛沙姆溶液中，搅拌均匀，最终浓度为2.5 mg/mL。

1.3.3 药物干预及分组

待肿瘤达到100 mm3时开始进行药物干预，将荷瘤小鼠按完全随机数表随机分为两组：空白对照组(control)、辛伐他汀组(SIM)，每组20只。异氟烷麻醉，使用微量注射器在小鼠胫骨上端穿刺，注射50 μg辛伐他汀水凝胶，观察肿瘤组织缺氧的变化与肿瘤血管形态的改变。

1.3.4 伊文氏蓝(Evans blue)染色检测肿瘤血管渗透性

小鼠采用戊巴比妥钠麻醉后，尾静脉注射2%的伊文氏蓝染料100 μL，循环20 min。取材，瘤体置于60℃条件下烤干16 h。然后将瘤体放入含1 mL的甲酰胺溶液的EP管中，在室温下浸泡72 h以提取染料。采用酶标仪在630 nm波长下分别测定各瘤体染料含量。

1.3.5 免疫荧光双染观察血管周细胞

将小鼠组织标本取材后，分别放入4%多聚甲醛和液氮中保存，OCT包埋，使用冰冻切片机将肿瘤组织切片，7 μm厚，0.2%Triton-100冰上破膜，1%正常山羊血清封闭1 h，切片上同时滴加两种一抗：兔抗CD31多克隆抗体(1∶200)和Cy3标记的鼠抗α-SMA单克隆抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，加DyLight-488羊抗兔二抗(1∶500)室温避光孵育1 h，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察拍照，Image J软件统计分析，计算α-SMA+/CD31+周细胞覆盖率。

1.3.6 免疫组化检测HIF-1α的表达

将甲醛固定的标本石蜡包埋，切片，5 μm厚，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，封闭，加兔抗HIF-1α多克隆抗体(1∶100)4℃孵育过夜，次日加羊抗兔二抗在室温下孵育30 min，加入DAB显色液，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

1.3.7 HE染色观察肿瘤坏死面积

将石蜡切片，经过二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，使用苏木素染色，用含有1%盐酸的酒精进行分色，脱去残余的染料，加入1%的伊红染液，梯度酒精分色及脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，Image J软件统计分析，计算肿瘤的坏死面积。

1.4统计学方法

2 结果

2.1骨内单次注射辛伐他汀降低乳腺癌肿瘤组织血管渗透性

伊文氏蓝灌注法检测血管渗透性，结果显示空白对照组染料外渗至肿瘤间质的量为(0.58±0.38) μg/g，而辛伐他汀组伊文氏蓝染料的外渗量为(0.26±0.31)μg/g，肿瘤血管中染料的外渗量明显减少(图1)，差异有显著性(P< 0.05)，说明骨内注射辛伐他汀能够降低肿瘤血管的渗透性。

注：与Control组比较，* P < 0.05。图1 肿瘤间质的伊文氏蓝渗透量Note. Compared with control group,* P < 0.05.Fig.1 Interstitial infiltration of Evans blue

2.2骨内注射单次辛伐他汀促进乳腺癌血管结构成熟

免疫荧光染色分别标记代表血管内皮细胞的CD31和代表血管壁周细胞的α-SMA，观察骨内单次注射辛伐他汀后肿瘤血管周细胞的覆盖情况。血管周细胞覆盖率是指周细胞(α-SMA+)表达的血管占所有血管(CD31+)的百分比。观察发现α-SMA+在辛伐他汀组(SIM)与空白对照组(control)相比明显增多，使用Image J软件分析发现α-SMA+/CD31+比率明显上升(图2)，表明肿瘤血管的周细胞覆盖明显增多。

注：A：免疫荧光图；B：统计学分析。与Control 比较，* P < 0.05。图2 肿瘤血管α-SMA+/CD31+免疫荧光双染及统计结果Note.A: Immunofluorescence staining; B: Quantifications of α-SMA+.Compared with control group, * P < 0.05.Fig.2 Co-immunofluorescence stain with CD31 and α-SMA of tumor vessels

2.3骨内单次注射辛伐他汀改善乳腺癌肿瘤组织缺氧

采用免疫组化对小鼠乳腺癌组织切片进行HIF-1α染色，用来评价肿瘤组织内部的缺氧程度，结果显示HIF-1α阳性细胞数量在辛伐他汀组与对照组相比显著降低(图3)。说明肿瘤内部的缺氧情况经过骨内注射辛伐他汀的作用得到改善，其作用机制可能与肿瘤新生血管的正常化有关。

图3 肿瘤组织HIF-1α免疫组化染色Fig.3 Immunohistochemical staining of HIF-1α in the tumor tissue

注：A：HE染色；B：统计学分析。与Control 比较，* P < 0.05。图4 肿瘤组织坏死面积HE染色及分析Note.A: HE staining; B: Quantifications of tumor necrosis area. Compared with the control group, * P < 0.05.Fig.4 HE staining and analysis of tumor necrosis area

2.4骨内单次注射辛伐他汀减少乳腺癌肿瘤坏死面积

通过对肿瘤组织做HE染色观察发现，辛伐他汀组的肿瘤坏死面积与对照组相比明显减少，差异有显著性(图4)。

3 讨论

传统抗血管治疗方法旨在阻断肿瘤血管的生成，通过使用血管抑制剂破坏肿瘤血管的生长，期待能够减少肿瘤的血液供应，造成肿瘤组织的缺血缺氧从而“饿死”肿瘤细胞[15]。然而，血管抑制剂的过度应用使肿瘤血管严重退化，阻碍药物和氧份的输送而拮抗化疗和放疗的效果，并导致肿瘤细胞对缺氧环境的耐受，促使肿瘤细胞分泌血管生长因子进入肿瘤微环境，导致肿瘤进一步恶化[3]。近年来有研究发现，合理应用抗血管生成药物能够在短期内使肿瘤血管“正常化”，并且能够促进化疗药物的敏感性[16]。Jain[17]提出抗血管生成药物的合理应用，能够在血管消退之前修复“不正常”的肿瘤血管，使更有效的运输氧和药物到达肿瘤内部，从而提高放化疗的敏感性。尽管如此，目前用于促进“血管正常化”研究的药物大多是抗血管生成剂[18,19]，而抗血管生成的药物很难精确控制其剂量，过多或过少都会影响其效果，并且伴随着许多副作用[20,21]。

辛伐他汀作为HMG-CoA还原酶抑制剂，是甲羟戊酸通路中的一种限速酶。甲羟戊酸通路影响着体内合成多种生化分子的过程，包括合成胆固醇和类异戊二烯等，因此他汀类药物的体内应用显示出其降脂以外的“多效性作用”[22]。

体外研究发现，辛伐他汀降低MDA-MB231和BT-20乳腺癌细胞的迁移能力[23]。可通过甲羟戊酸途径诱导PI3K/Akt和MAPK/ERK信号传导的失活，从而诱导乳腺癌细胞死亡[24]。不同剂量的他汀能够产生不同的疗效，低剂量促进血管生成，高剂量抑制血管生成[25]。有研究表明，低剂量辛伐他汀能够上调eNOS表达，促进周细胞的募集；高剂量辛伐他汀通过抑制ROS介导的VEGF的表达，达到抑制血管生成、降低肿瘤血管渗透性的作用[13]。但系统应用他汀类药物生物利用度低，口服后不到5%的药物能够进入血液循环[26]，想要发挥作用需要服用过高的剂量。本课题组前期研究发现，骨内单次注射辛伐他汀，能够通过上调VEGF和BMP2的表达促进骨和血管生成[8]。作用机制主要是辛伐他汀能够动员骨髓内的EPCs进入外周血，达到组织缺血的部位参与血管的形成。

本课题组通过建立4T1小鼠乳腺癌模型，研究发现骨内单次注射辛伐他汀促进代表肿瘤血管周细胞的α-SMA表达增多，提示肿瘤血管的完整性增加。血管的稳定主要依赖内皮细胞和周细胞，而有研究表明周细胞来源于骨髓[11]，因此我们推测骨内注射辛伐他汀是通过动员骨髓内的周细胞到达肿瘤血管，从而促进肿瘤血管正常化。

肿瘤血管正常化的另一项观察指标是血管的渗透性，成熟的血管渗透性降低[27]，我们使用伊文氏蓝灌注发现，辛伐他汀组的肿瘤渗透性明显降低。血管渗透的减少能够使得输送更多的氧气和化疗药物到达肿瘤中心，减轻肿瘤的缺血缺氧状况。HIF-1α在缺氧介导的细胞凋亡和肿瘤增殖中具有至关重要的作用，能够通过对多种肿瘤靶基因的调控促进侵袭和转移能力[28]，它受细胞内部的氧分压精细调节，在缺氧条件下，HIF-1α的诱导速度加快，而其降解过程受阻，表达水平迅速升高，是反应肿瘤缺氧状况的重要标志[29]。我们使用免疫组化对肿瘤组织染色发现，通过骨内注射辛伐他汀，肿瘤组织中HIF-1α的表达明显减少，差异有显著性(P< 0.05)，提示肿瘤内部缺氧得到改善。肿瘤血管正常化使得肿瘤间质液压降低，化疗药物更容易到达肿瘤组织发挥作用，从而与化疗药物产生协同作用。通过肿瘤内血流的改善，使更多的化疗药物进行有效的灌注[30]，或将为肿瘤的化疗提供新的治疗策略，这也是未来重点研究的方向。

总之，本研究发现，通过骨内单次注射小剂量辛伐他汀，促进小鼠乳腺癌肿瘤血管正常化，改善肿瘤局部缺氧。

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Studyontheeffectofsingledoseintraosseousinjectionofsimvastatinontumorvascularnormalizationinmurinebreastcancer

HAI Bao1, LIU Can1, ZHANG Wen1, ZHU Jun-xiong1, CAO Bao-shan3, SONG Chun-li1,2*

(1.Department of Orthopedics, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China; 2.Beijing Key Laboratory of Spinal Diseases, Beijing 100191; 3.Department of Cancer Chemotherapy and Radiology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191)

ObjectiveTo investigate the effect of single dose intraosseous injection of simvastatin on tumor vascular structure and function in murine breast cancer.MethodsBALB/c mice and 4T1 murine breast cancer cells were used to establish a subcutaneous xenograft model. The mouse model of orthotopic breast cancer

intraosseous injection of a single dose of simvastatin (50 μg) or vehicle only. Frozen tumor tissue sections were prepared for co-immunostained with CD31 and α-SMA. Evans blue dye was injected into the tail vein to observe the vascular permeability. The expression level of HIF-1α was detected by immunohistochemistry.ResultsImmunofluorescence dual staining showed that intraosseous injection of simvastatin increased the number of perivascular pericytes in the tumor vessel(P< 0.05), Evans blue dye content showed that in vivo vessel permeability in the tumor tissue was significantly decreased(P< 0.05),and the immunohistochemistry results showed that local hypoxic area was significantly improved.ConclusionsSingle dose intraosseous injection of simvastatin can promote the normalization of tumor vasculature by improving the coverage of pericytes.

Simvastatin; Intraosseous injection; Vasculature normalization; Breast cancer; Pericyte

R-33

A

1671-7856(2017)010-0001-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.010.001

2017-04-25

国家自然科学基金项目(81672133,81641079)；国家高技术研究发展计划(2015AA020304)。

海宝(1989-)，男，硕士生，专业：外科学。E-mail: haibao@bjmu.edu.cn

宋纯理(1971-)，男，研究员，研究方向：骨质疏松、骨折愈合。E-mail: schl@bjmu.edu.cn