siRNA沉默MACC1基因表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响

杜 珍，陈志美，周道秋，黄洁萍

(海南省第二人民医院妇产科，海南 五指山 572299)

研究报告

siRNA沉默MACC1基因表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响

杜 珍，陈志美，周道秋，黄洁萍

(海南省第二人民医院妇产科，海南 五指山 572299)

目的探讨siRNA沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达对Hela宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法通过脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转入Hela细胞中，RT-PCR及western blot检测转染效果，MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期，Transwell法检测细胞侵袭能力，western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E，基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。结果与siRNA NC组比较，siRNA MACC1组中MACC1蛋白及mRNA表达量降低(P< 0.01)，细胞活力及侵袭能力下降(P< 0.01)，细胞周期阻滞在G1期，cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表达量下调(P< 0.01)。结论siRNA MACC1能显著的抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭，可能与下调ERK磷酸化水平有关。

结肠癌转移相关基因1(MACC1)；宫颈癌；增殖；侵袭

宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，近些年来由于宫颈癌细胞筛查技术的推广使得宫颈癌的发病率及死亡率均有所下降，但是随着高危型人乳头状病毒(HPV)持续感染的增加，导致了目前宫颈癌的发病年龄呈现了年轻化[1, 2]。同时宫颈癌的发病机制到目前为止还未详细阐述，因此从分子水平上进一步的探讨宫颈癌的发病机制对于宫颈癌的诊断，基因治疗及预后将具有重大意义。Stein等学者在2009年结肠癌研究中发现了结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)，且后续研究表明MACC1在众多的肿瘤组织中高表达，并与肿瘤的侵袭转移密切相关[3-6]。也有众多学者研究发现MACC1在正常宫颈组织，中-重度宫颈上皮内瘤变组织，宫颈癌组织中逐渐高表达，且发现MACC1在宫颈癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用[7, 8]。但MACC1在宫颈癌细胞的增殖及侵袭中的作用还未见报道，因此本研究将较为详细的阐述此作用机制。

1 材料和方法

1.1细胞株

宫颈癌细胞Hela购自中国科学院细胞库，目录号TCHu187。

1.2主要试剂和仪器

兔抗人MACC1、cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9、ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人GAPDH单克隆抗体，BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；胎牛血清，DMEM培养基购自Hyclone公司；transwell 小室购自美国Corning 公司；siRNA MACC1及siRNA NC购自上海吉玛生物制药公司；一步法RT-PCR扩增试剂盒，trizol RNA提取试剂盒购自大连宝生生物技术有限公司。DYCZ-25D型双垂直电泳仪，DYCZ-25D型转印电泳仪购自北京六一仪器厂；GelDoc 2000凝胶成像系统购自美国伯乐公司；Biosciences FACSAria流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3实验方法

1.3.1 siRNA的转染

当Hela细胞生长达到50%左右的时候，利用脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转染到Hela细胞中，6 h后换液，继续培养48 h，利用RT-PCR法及western blot法检测转染效果。

1.3.2 MTT法检测细胞活力

将Hela细胞接种到96孔板，培养24 h后，按“1.3.1”进行转染，继续培养48 h后，加入MTT 20 μL，培养4 h，将96孔板翻过来弃去上清液，再往96孔板中每个孔加入150 μL的二甲基亚砜，96孔板在微量振荡器中震荡约10 min，最后在酶标仪中检测OD值，波长选择为560 nm，OD值即是细胞活力。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期

将Hela细胞接种到6孔板，培养24 h后，按“1.3.1”进行转染，继续培养48 h后，每组分别收集1×105/mL个细胞，加入Rnase(终浓度为10 mg/mL)5 μL，小心吹打吹打混匀后，室温下孵育1 h，再加入PI染液，继续吹打混匀，并在室温下避光孵育30 min，于1 h内在流式细胞仪进行细胞周期检测分析。

1.3.4 Transwell法检测细胞侵袭能力

将matrigel胶平铺于Transwell小室微膜上以被使用。利用0.25%胰蛋白酶将按“1.3.1”进行转染并培养了48 h的Hela细胞消化下来，离心收集细胞后，将细胞接种到Transwell的上室，下室不接种细胞，仅加入DMEM培养基，48 h后，将Transwell小室取出来，用4%的多聚甲醛固定5 min，PBS洗涤后，结晶紫再染色5 min，在倒置显微镜下观察，并取5个视野中的细胞数目进行计数，取平均值，即为细胞的侵袭数目。

1.3.5 RT-PCR检测MACC1 mRNA的表达

采用trizol RNA提取试剂盒提取细胞总的RNA，并用检测总RNA的纯度，当检测结果OD260/OD280在1.8～2.1之间，说明RNA纯度的良好，可以接着采用一步法RT-PCR试剂盒逆转录RNA，而逆转录产物cDNA进行扩增，最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。引物如下。MACC1上游引物：5’-AACCCCAAACCTAAAAAGACTC-3’，下游引物：5’-ACCCAGGACATCAGCTAAAACT-3’，GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。

1.3.6 Western blot检测cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK的表达

在冰浴条件下把细胞刮下来，离心加入细胞裂解液进行裂解，大约30 min，并在4℃条件下离心，收集到的上清液即是总蛋白。接着采用BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白定容后，在微波炉上煮沸变性。制作浓缩胶和分离胶，并蒸馏水封闭。然后蛋白样品上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，湿法转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗溶液(兔抗人cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9、ERK1/2，p-ERK1/2及GAPDH多克隆抗体，稀释度为1∶100)孵育，4℃过夜；第二天在二抗溶液中室温条件下孵育1～2 h。最后在凝胶成像系统中曝光。

1.4统计学方法

2 结果

2.1siRNAMACC1对Hela细胞中MACC1表达的影响

如图1所示，与siRNA NC组中MACC1蛋白(1.07±0.10)及mRNA(0.69±0.07)表达比较，siRNA MACC1组MACC1蛋白(0.29±0.03)及mRNA(0.12±0.01)表达下调，差异有显著性(P< 0.01)。

2.2siRNAMACC1对Hela细胞活力的影响

Hela细胞转染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后经MTT实验发现，二者细胞活力分别为(0.73±0.07)、(0.38±0.03)，差异有显著性(P< 0.01)。

2.3siRNAMACC1对Hela细胞周期的影响

如表1所示，Hela细胞转染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后经流式细胞周期实验发现，siRNA MACC1能使细胞周期阻滞在G1期。

2.4siRNAMACC1对Hela细胞侵袭能力的影响

如图2所示，Hela细胞转染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后经transwell侵袭实验发现，二者细胞侵袭数目分别为(159.65±15.94)、(38.59±3.86)，差异有显著性(P< 0.01)。

2.5siRNAMACC1对Hela细胞中cyclinD1及cyclinE表达的影响

如图3所示，Hela细胞转染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后经western blot实验发现，与siRNA NC组中cyclin D1(0.54±0.05)及cyclin E(0.60±0.06)表达比较，siRNA MACC1组cyclin D1(0.15±0.01)及cyclin E(0.20±0.02)表达下调，差异有显著性(P< 0.01)。

2.6siRNAMACC1对Hela细胞中MMP2及MMP9表达的影响

如图4所示，Hela细胞转染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后经western blot实验发现，与siRNA NC组中MMP2(1.19±0.12)及MMP9(1.03±0.10)表达比较，siRNA MACC1组MMP2(0.30±0.03)及MMP9(0.24±0.02)表达下调，差异有显著性(P< 0.01)。

2.7siRNAMACC1对Hela细胞中EKR磷酸化水平的影响

如图5所示，Hela细胞转染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后经western blot实验发现，与siRNA NC组(1.38±0.12)比较，siRNA MACC1组(0.46±0.04)p-ERK1/2表达下调 (P< 0.01)。

A:蛋白表达；B：mRNA表达。图1 siRNA MACC1对Hela细胞中MACC1表达的影响(n=6)Note.A:Protein expression;B：mRNA expression.Fig.1 Effect of siRNA MACC1 on the expression of MACC1 in Hela cells

Tab.1Effect of siRNA MACC1 on Hela cell cycle

组别GroupsG1期G1phageS期SphageG2期G2phagesiRNANC4837±4901643±1643520±352siRNAMACC16254±629∗∗1148±120∗∗2598±260∗∗

注：与siRNA NC比较，**P< 0.01。

Note.Compared with the siRNA NC group,**P< 0.01.

图2 siRNA MACC1对Hela细胞侵袭能力的影响( ×200)Fig.2 Effect of siRNA MACC1 on the invasion ability of Hela cells

图3 siRNA MACC1对Hela细胞中CyclinD1及CyclinE表达的影响Fig.3 Effect of siRNA MACC1 on the expression of cyclin D1 and cyclin E in Hela cells

图4 siRNA MACC1对Hela细胞中MMP2及MMP9表达的影响Fig.4 Effect of siRNA MACC1 on the expression of MMP2 and MMP9 in Hela cells

图5 siRNA MACC1对Hela细胞中p-ERK1/2表达的影响Fig.5 Effect of siRNA MACC1 on the expression of p-ERK1/2 in Hela cells

3 讨论

2009年Stein等学者通过基因比对技术在结肠癌的研究中发现了一种与结肠癌转移密切相关的基因，并命名为MACC1。MACC1位于人第7号染色体上，所编码的蛋白质由852个氨基酸组成。此蛋白质结构域包括ZU5，SH3及死亡结构域等，能够介导蛋白质之间相互作用，信号传导，也能够参与细胞凋亡，迁移，炎症反应及免疫调节[5, 6]。MACC1是HGF/c-Met信号通路中关键调节因子，能够结合于c-Met启动子，激活此信号通路，进而调控下游靶基因的转录表达，也能够促使c-Met自身发生磷酸化，进而介导多种生物学反应[5]。众多研究已经表明MACC1在宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等多种妇科肿瘤中高表达，并与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关[5, 7, 8]。另外研究还表明siRNA MACC1能够显著的抑制宫颈癌细胞的侵袭转移，与下调MMP2及MMP9表达有关[9]。但是目前MACC1在宫颈癌细胞的增殖及侵袭中的作用报道较少，并且相应作用机制不清楚，因此本课题组将对此展开研究。本研究首先利用脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转染到宫颈癌细胞Hela中，并利用western blot及RT-PCR证实转染成功。接着采用MTT法检测siRNA MACC1对Hela细胞活力的影响，结果表明siRNA MACC1能显著的降低Hela细胞活力，与Zhou等[9]研究一致。

肿瘤细胞增殖旺盛源于细胞周期的紊乱，细胞周期相关蛋白异常表达，使细胞周期调控系统失去控制，导致细胞中蛋白质合成远大于分解，细胞有丝分裂加快，细胞不断增值。其中G1期，G2期是细胞周期主要调控点，是众多抗肿瘤药物作用靶点[10, 11]。cyclin D1是与G1期密切相关的细胞周期蛋白，在G1期合成并达到顶峰，能与CDK4/6结合形成复合物，促使下游核转录因子进入细胞核与细胞增殖相关基因结合，并促使其转录，最终使得G1期向S期迅速转换。cyclin E亦是与G1期相关的细胞周期蛋白，能在cyclin D1降解后，与CDK2结合，促进DNA继续复制。另外肿瘤细胞的侵袭转移是导致外科手术失败的重要因素之一。其中细胞外基质的降解能够促使肿瘤细胞的快速迁移，介导这一个过程的是蛋白水解酶，其中最为主要的是MMPs。MMP2在降解细胞外基质成分的同时还能够诱导新生血管的发生，进而促进肿瘤细胞的迁移、扩散及转移。MMP9是分子量最大的MMPs，几乎能够降解所有的细胞外基质成分，包括Ⅳ胶原。而且有研究表明siRNA MACC1能够通过下调cyclin D1，cyclin E表达，并使细胞周期阻滞在G1期，进而遏制胶质瘤细胞U251的增殖[12]。另外也有研究表明siRNA MACC1能够抑制大肠癌细胞的迁移侵袭与下调MMP2，MMP9的表达有关[13]。因此探讨siRNA MACC1对Hela细胞周期、细胞侵袭、细胞周期相关蛋白及MMPs表达的影响将具有重要意义。所以本研究进一步检测了siRNA MACC1对Hela细胞周期，细胞侵袭能力，细胞周期蛋白及MMPs表达的影响，结果表明siRNA MACC1能使细胞周期阻滞在G1期，降低细胞侵袭能力，下调cyclin D1，cyclin E，MMP2及MMP9表达，最终抑制Hela细胞的增殖与侵袭。

细胞的凋亡，增殖，分化，细胞周期，细胞迁移及侵袭等等生物学过程受多种信号通路的调控，MAPK信号通路就是其中的一种[14]。MAPK家族包括ERK，JNK及p38 MAPK三个主要亚族。其中EKR是此信号通路的关节调控点，包括5个亚族(ERK1-5)，其中EKR1和ERK2研究得最为彻底，能通过自身磷酸化并将信号传递给下游基因进而调控细胞的生命过程。且有研究表明MACC1能够通过MAPK信号通路级联反应参与乳腺癌的发生发展[15]。提示MACC1可能也可以通过此信号通路影响宫颈癌的发生发展。所以本研究接着利用western blot检测siRNA MACC1对Hela细胞中ERK1/2磷酸化水平的影响，结果表明siRNA MACC1能显著的下调p-ERK1/2表达，进而遏制Hela细胞的增殖与侵袭。

综上所述，siRNA MACC1能显著降低Hela细胞活力，使细胞周期阻滞在G期，并降低细胞侵袭能力，是通过下调cyclin D1、cyclin E、MMP2及MMP9表达实现的，可能与抑制ERK信号通路激活有关。

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EffectofsilencingMACC1geneonproliferationandinvasionofcervicalcancercells

DU Zhen， CHEN Zhi-mei， ZHOU Dao-qiu， HUANG Jie-ping

(Department of Obstetrics and Gynecology; the Second People’s Hospital of Hainan province，Wuzhishan 72299，China)

ObjectiveTo explore the effect of silencing metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) gene on proliferation and invasion of cervical cancer Hela cells.MethodssiRNA MACC1 and siRNA NC were transfected into cervical cancer Hela cells with liposomes. The expression of MACC1 protein and mRNA was detected by western blot and RT-PCR. Cell viability and invasion ability were measured by MTT and transwell assay, respectively. The expression of cyclin D1, cyclin E matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9 and the level of extracellular regulated protein kinases (ERK) phosphorylation was detected by western blot.ResultsCompared with siRNA NC, the expression of MACC1 protein and mRNA was down-regulated, cell viability and invasion ability were reduced (P< 0.01), cell cycle was arrested at G1 phase (P< 0.01), the expression of cyclin D1, cyclin E, MMP2, MMP9 and p-ERK1/2 was down-regulated (P< 0.01).ConclusionssiRNA MACC1 can inhibit proliferation and invasion of cervical cancer Hela cells, which migiht be related to down-regulation of p-ERK.

Metastasis-associated in colon cancer 1(MACC1); Cervical cancer; Proliferation; Invasion

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0080-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.016

2017-04-14

杜珍(1966-)，女，本科，副主任医师，研究方向：妇科宫腔镜。E-mail: 1137232558@qq.com