吲哚美辛亲水凝胶贴剂定量方法与前处理提取工艺正交优化

郭文韬 ，谢伟杰 ，2，张永萍 ，徐 剑

（1贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002； 2中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193）

吲哚美辛亲水凝胶贴剂定量方法与前处理提取工艺正交优化

郭文韬1，谢伟杰1，2，张永萍1，徐 剑1

（1贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002； 2中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193）

目的优化吲哚美辛亲水凝胶贴剂的提取工艺与含量测定方法。方法利用高效液相色谱(HPLC)－工作曲线进行定量，通过单因素考察与正交设计优化贴剂的提取方法、提取溶剂、时间与预处理方法。结果最终确定贴剂的提取条件是将贴剂膏体剪碎后，50 mL甲醇提取90 min，提取1次，或用25 mL甲醇提取60 min，提取2次。结论优化的贴剂中药物提取工艺条件稳定、可靠，可为贴剂的质量评价提供良好的方法。

正交设计；提取工艺；吲哚美辛；含量测定；亲水凝胶；贴剂

吲哚美辛为非甾体类镇痛抗炎药，具有载药量大、适用范围广、贴敷性与保湿性好、无致敏性等优点，对多种炎性疼痛有明显的镇痛效果，但该药口服制剂常规剂量即可引发部分患者胃肠道和中枢神经系统的毒副作用，故现在多采用经皮给药[1－2]。前期对吲哚美辛药物透皮特性与pH的关系、吲哚美辛新型亲水凝胶基质处方等[3－5]进行了考察，成功制备了吲哚美辛亲水凝胶贴剂。本研究中通过单因素考察与正交设计试验对该贴剂的质量标准进行了初步研究，建立了该贴剂含药量检测方法，确定了含药量，为付罐促渗新技术[6]研究奠定了基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AE／240型电子天平（上海梅特勒仪器有限公司）；JA2003型分析天平（上海良平仪表有限公司）；SK8210HP型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；DZ－2BC型真空干燥箱（天津市泰斯特有限公司）。

1.2 试药

吲哚美辛对照品[高效液相色谱(HPLC)法测得含量约 99.9%，购于中国食品药品检定研究院，批号为100258－00904]；吲哚美辛亲水凝胶贴剂（贵阳中医学院药物制剂实验室提供，批号为2015051601）；甲醇（色谱纯，批号为 20141010）；乙腈（色谱纯，批号为 20150610）；乙醇（分析纯，批号为20141010），均为天津市科密欧化学试剂有限公司产品；冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号为20150505）；娃哈哈纯净水；其他试验用试剂均为分析纯，试验用水为自制双蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 主药含量测定(HPLC法)

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Inertsil ODS－SP 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 － 水 － 冰醋酸（55 ∶44.7 ∶0.3）；检测波长：228 nm；柱温：35 ℃ ；流速：1 mL ／min；进样体积：10 μL。在此条件下，吲哚美辛色谱峰相对保留时间（tR）为（11.8 ± 0.2）min，理论板数不小于 4 000，目标峰与相邻杂质峰完全分离，分离度（R）≥2.5。

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：称取吲哚美辛对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，定容，制成质量浓度为 266.40 μg／mL 溶液，作为对照品贮备液；取2 mL稀释，定容至10 mL，得质量浓度为53.28 μg／mL的对照品溶液。使用时根据需要稀释到不同质量浓度。

供试品溶液：取贴剂的提取溶液2 mL，用0.45 μm针筒式微孔滤膜滤过，即得。

阴性对照品溶液：取不含吲哚美辛的空白亲水凝胶贴剂，按提取工艺条件提取后，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果供试品溶液与对照品溶液在 tR＝（11.9±0.2）min处均出现目标成分色谱峰，而阴性对照品溶液无此色谱峰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

线性关系考察：取对照品贮备液，稀释成质量浓度依次为 5.328，13.320，26.640，39.960，53.280，79.920，106.560 μg／mL的系列对照品溶液，按拟订色谱条件分别进样10 μL，测定峰面积，以质量浓度（C）为纵坐标、峰面积（A）为横坐标进行线性回归，得回归方程 C＝0.030 1 A－0.734 4，r＝0.999 8(n＝7)。结果表明，吲哚美辛质量浓度在 5.328 ～106.560 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，重复进样6次，测定峰面积。结果的 RSD依次为1.00%和 0.66% （n＝ 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，按拟订色谱条件分别于 2，6，10，14，18，24 h 时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 2.98%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密取同一批号样品，依法制备得6份等浓度供试品溶液，在上色谱条件下分别进样10 μL，测定峰面积。结果的 RSD 为 1.00% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的贴剂样品6份（膏体为0.275 g），分别加入对照品，按正交试验优选的提取工艺提取后依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样10 μL，测定含量，计算回收率。结果见表 1。

图1 高效液相色谱图

表1 吲哚美辛加样回收试验结果

2.2 贴剂提取工艺考察

溶剂种类：按扩散池外接口面积3.14 cm2，裁剪固定大小的吲哚美辛贴剂，共3份，每份称取0.613 g，精密称定，分别用25 mL的移液管精密吸取甲醇、乙醇、20%的乙醇磷酸盐缓冲溶液（pH＝7.3）各 25 mL，置50 mL锥形瓶，称定质量，超声提取30 min后，补足丢失的质量，过滤，取续滤液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。按拟订色谱条件，进样 10 μL，测定峰面积，并计算吲哚美辛含量。结果见表2。可见，以甲醇为提取溶剂效果最佳，故选用之。

表2 不同种类提取溶剂考察结果

酸处理：按扩散池外接口面积3.14 cm2，裁剪固定大小的吲哚美辛贴剂，共3份，每份称取0.524 g，精密称定，使用移液器分别转移2%盐酸、2%磷酸、蒸馏水各1 mL，置50 mL锥形瓶中，浸润吲哚美辛贴剂膏体5 min，然后用25 mL的移液管精密吸取25 mL的甲醇，称定质量，超声提取30 min后，补足丢失的质量，过滤，取续滤液，用 0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。按拟订色谱条件进样10 μL，测定峰面积并计算吲哚美辛含量。结果见表3。可见，采用蒸馏水作酸处理效果最佳，故选用之。

表3 不同酸处理考察结果

贴剂膏体处理：按扩散池外接口面积3.14 cm2，裁剪固定大小的吲哚美辛贴剂，共3份，每份称取0.599 g，精密称定，分别按如下方法处理。剪碎处理，取1份，用剪刀剪成1 mm×1 mm的小块；匀浆处理，使用匀浆机，加入5 mL甲醇中处理2 min，转移到50 mL的锥形瓶中，并精密吸取5 mL甲醇润洗器壁3次；不作处理。加入25 mL甲醇，称定质量，超声提取30 min后，补足丢失的质量，过滤，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。按拟订色谱条件进样10 μL，测定峰面积，并计算吲哚美辛含量。结果见表4。可见，采用剪碎处理贴剂膏体，效果最佳，故选用之。

表4 贴剂膏体不同处理方法考察结果

单因素考察结果表明，贴剂含量测定提取时最优方案为将贴剂膏体剪碎后使用甲醇提取，其他不作处理。但剪碎与匀浆处理的提取效果差异不显著，后期试验中宜灵活选择。

2.3 贴剂提取工艺正交试验优选

2.3.1 因素与水平选择

[7－9]，在单因素考察基础上采用正交试验进一步对贴剂提取工艺的主要影响因素，包括提取方法（因素 A）、溶剂用量（因素 B）、提取时间（因素 C）进行考察。常用的提取方法有回流提取、超声提取、浸提，由于各提取方法的提取时间不能采用统一的标准，故采用相对时间“短、中、长”分别表示各方法的提取时间。详见表5和表6。

表5 提取时间水平编码表

表6 影响因素与水平表

2.3.2 正交设计

依据单因素考察结果与因素水平表安排 L9（34）正交试验，按“随机”的原则取贴剂：每贴按扩散池外接口面积3.14 cm2，裁剪为3份，每份分成9小块，将每块随机分配正交9组，每组于每贴取3块，依次取3贴，共9块，精密称取总质量0.550 g。将各组贴剂膏体剪碎处理后，分别按正交表提取，补足丢失的质量，过滤，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。按拟订色谱条件进样10 μL，测定峰面积，计算各组吲哚美辛的含量。正交试验设计表与直观分析结果见表7。

表7 贴剂提取工艺 L9（34）正交试验设计与直观分析结果

2.3.3 方差分析

用Excel软件对试验数据进行方差分析，结果见表8。可见，因素A、因素B、因素C对提取工艺具有非常显著的影响。同时直观分析结果表明，3种因素提取效果A1＞ A3＞ A2，B2＞ B1＞ B3，C3＞ C2＞ C1。因此，确定提取工艺最佳因素水平组合为A1B2C3，即采用回流法，用25 mL甲醇提取120 min，提取1次。

表8 方差分析结果

2.3.4 验证试验

取3份贴剂（0.550g），按优选的工艺条件提取，过滤后，取2 mL，制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样10 μL，测定吲哚美辛含量（M，mg），结合方法学考察，以重复性试验测得样品中吲哚美辛含量为参比，计算相对提取率（Q，%），即为验证组（提取 1次）。

结合以上研究结果，取3份样品分别用甲醇25 mL回流提取2次，每次60 min，第1次提取后精密吸出提取液20 mL，加入25 mL甲醇再次提取，补足丢失的质量，过滤，作为对比 1 号组；另取 3 份样品（0.550 g），分别用甲醇50 mL回流提取90 min，提取1次，作为对比2号组，分别测定M值，计算Q值。试验结果见表9。其中对比1号组、对比2号组较验证组提取效果更好，且对比2号组优于对比1号组，但组间差异均不大。

表9 验证试验与对比组结果

2.4 提取工艺确定

通过单因素考察与正交试验优选，结合后期研究结果，确定采用对比2组方法提取贴剂中吲哚美辛含量：将贴剂膏体（固定面积 3.14 cm2，质量 0.5 ～ 0.6g）剪碎后，用50 mL甲醇提取90 min，提取1次。若提取透皮后皮肤中吲哚美辛含量，可采用对比1组方法提取：将贴剂膏体（固定面积 3.14 cm2，质量 0.5 ～ 0.6 g）剪碎后，用25 mL甲醇提取60 min，提取2次。

2.5 载药量测定

根据提取方法优选结果，取各组制备贴剂，各取3贴，取贴剂部分膏体 0.6 ～0.7 g，剪碎后，用 50 mL 甲醇提取90 min，提取1次。按定量方法测定各组样品贴剂载药量，同时计算与12.5 mg标示量的偏差（%）。结果见表 10。可见，各组贴剂含药量基本处于（12.5 ± 0.5）mg，偏差率0.5%，即该制剂产品质量基本稳定。

表10 各组贴剂含药量考察结果（n＝3）

2.6 贴剂质量标准初步评价

对吲哚美辛贴剂质量标准进行初步评价[10－13]。

处方组成：聚乙烯醇（PVA）17.350 g、明胶 9.999 g、聚乙烯吡咯烷酮6.260 g、羧甲基纤维素钠（CMC－Na）8.140 g、卡波姆 3.000 g、甘油 12.880 g、丙二醇 12.880 g、三乙醇胺4.200 g，加5%薄荷油作为促渗剂，载药量12.5 ～ 13.0 mg。

性状：该制剂产品为无色透明、柔软而富有弹性、凝胶薄片状贴剂。加入薄荷油后略显淡黄色。

规格：直径7 cm圆形贴片，载药量12.5 mg。

贴剂成品见图2。

图2 吲哚美辛亲水凝胶贴剂成品图

3 讨论

本研究中对吲哚美辛亲水凝胶贴剂质量标准的“含量测定”进行全面考察。结合2010年版《中国药典(二部)》确定的高效液相色谱定量条件[7－15]。方法学考察结果表明，该方法准确、简单、稳定、可靠、重复性好，可用于吲哚美辛亲水凝胶贴剂离体透皮含量测定。

本研究中利用单因素考察与正交设计[7－8]考察了贴剂提取的工艺条件，为贴剂含量测定提供了可靠的工艺条件，提供了贴剂在体皮肤组织给药后测定优化方案，最终确定了贴剂的提取条件，同时对各组贴剂含药量进行测定。结果表明，该制剂产品质量基本稳定，为后期促渗在体研究奠定了良好的方法基础。为了进一步确定该新型贴剂的质量，后期研究主要采用体内外透皮释放与载体吸收药动学方法进行评价研究。

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Optimization of Extraction Process of Quantitative Method and Pretreatment of Indomethacin Hydrophilic Gel Patch by Orthogonal Design

Guo Wentao1， Xie Weijie1，2， Zhang Yongping1， Xu Jian1
(1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang， Guizhou， China 550002； 2.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Beijing Union Medical College， Beijing， China 100193）

Objective To optimize the extraction process and content determination method of Indomethacin Hydrophilic Gel Patch.Methods Quantitative analysis was performed by using HPLC － working curves，the extraction method，extracting solvent，time and pretreatment method were extracted by means of single factor and orthogonal design optimization.Results Finally，the extraction conditions of the patch were：after the patch paste was cut and broken，50 mL methanol was extracted for 90 min and extracted 1 time， or 25 mL methanol was extracted for 60 min and extracted 2 times.Conclusion Drug extraction process conditions in optimized patches is stable and reliable，which provides a good method for the quality evaluation of the patch.

orthogonal design；extraction process；indometacin；content determination；hydrophilic gel；patch

TQ460.6；R944.2

A

1006－4931(2017)20－0013－05

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.004

国家苗药工程技术研究中心项目[2014FU125Q09]；贵州省科技厅“百层次人才”培养计划项目[黔科合人才[2015]4030号]；贵州省教育厅中药民族药（苗药）新剂型新制剂工程研究中心项目[黔教合KY字[2014]22号]；贵州省普通高等学校中药民族药制剂重点实验室[黔教合KY字[2016]005]。

郭文韬，男，在读硕士研究生，研究方向为新药开发，（电子信箱）479513290＠qq.com。

张永萍，女，教授，硕士研究生导师，研究方向为新药开发，（电话）0851－5652056（电子信箱）642055255＠qq.com。

2017－05－23；

2017－07－10)