甘草多糖试用3， 5 二硝基水杨酸比色法测定其多糖含量的考察

范文彤

【中图分类号】R629 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）10-0-01

理论与经验丰富的糖类科学家们很早就试图使用具有能够明显提高人类机体免疫应答的多糖类物质来预防和治疗疾病。其中尤以成分中富含大量多糖成分植物与动物的研究日趋受到科学家们重视与青睐。现阶段作为药物或保健品已问市的多糖类产品有香菇多糖、黄芪多糖、银耳孢糖、刺参多糖、纳豆多糖和甘草多糖等。

目前多糖的含量测定方法主体上有色谱法和比色法。色谱法是利用凝胶色谱技术将多糖与单糖或低聚糖分离后，再根据是否有对照品分别采取相应的方法测定，特点是结果准确但费用较高；比色法，是通过简单的水解反应后，经比色来进行测定的方法，其经常使用的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和3 5-二硝基水杨酸比色法（DNS 法）。在90 年代，美国公职分析化学家协会（AOAC） 将苯酚-硫酸法列为标准方法，但苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法只能测定总糖含量而不能分别测出单糖与多糖的含量。而DNS法[1]与前两种方法相对比，其最大的特点是，在碱性条件下显色，故可以准确测定单糖与总糖的含量，通过二者的差可以很快的计算出多糖的含量。本文选定使用3 5-二硝基水杨酸比色法测定了甘草多糖中多糖的含量并对其做了相应的方法学研究加以阐述及考察。

1 仪器与试剂

岛津公司UV-2450 型紫外-可见分光光度计，葡萄糖对照品由中国药品生物制品检定所提供，甘草多糖，甘草多糖对照品（按干燥品计算多糖含量为97.68%） 均由中新药业集团股份有限公司中新制药厂试制并提供。

2 测定方法

对照品溶液的制备 取在105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品约50mg，精密称定，置200ml量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀。

测定单糖用溶液的制备 取供试品约400mg，精密称定，置60ml小烧杯中，加纯化水30ml，40℃磁力搅拌30min，再在50℃超声中超声45min，冷却至室温，移至100ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃初滤液，收集续滤液，即得。

测定总糖用溶液的制备 取本品约100mg，精密称定，至250ml三角瓶中，加水100ml ，加入3mol/L硫酸（18→100）25ml，摇匀，在水浴中水解1.5小时，冷却至室温，加3至4滴酚酞指示剂，加10mol/L氢氧化钠溶液20ml，用10%氢氧化钠溶液回滴至中性（淡粉红色），加水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃初滤液，收集续滤液，即得。

测定法 精密量取上述对照品和供试溶液各2ml，置于大试管中，再精密量取DNS显色液1.5ml，加入混匀，置水浴中水浴15分钟后，取出，用冷水冷却至室温，移至25ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀。照分光光度法 （中国药典2015年版），在520nm波长处测定吸收度，同法测定空白，计算，即得。

多糖含量（%）=总糖含量（%）-单糖含量（%）

编号 含量（%）

1 68.77

2 67.63

3 66.87

甘草多糖纯品 97.68

3 方法研究

3.1 供试品溶液的稳定性考察

取显色后的供试品溶液分别放置于0、2、4、 6 、8 小时后，测定，测定结果见表1，结果表明：所测定的样品性质稳定，结果无明显差异，采用的供试品溶液的稳定性不随时间的改变而改变。

3.2 甘草多糖酸水解后产生还原糖的种类鉴定

甘草多糖酸水解后产生还原糖的种类鉴定：利用糖分析专用柱的HPLC法予以鉴定。

3.2.1 色谱条件与系统适用性试验

糖分析专用柱（4.6×250），乙腈-水（75：25）为流动相，示差折光检测器，柱温30℃，流速1ml/min。

在上述条件下，葡萄糖、果糖、蔗糖的分离度应符合规定，按葡萄糖峰计算，理论板数应不低于2500。

3.2.2 方法的检出限度

按5倍于基线噪音计算，果糖、葡萄糖、蔗糖的检出量为0.05μg。

3.2.3 測定结果

将含量测定项下水解后的供试品溶液用2mol/L氢氧化钠溶液调至中性后，以每分钟5000转离心30分钟，取上清液20μl注入液相色谱仪。结果出现单一峰，其保留时间与葡萄糖对照品峰一致经加入法验证峰形未发生变化，故初步鉴定：甘草多糖酸水解生成葡萄糖，故在含量测定中用葡萄糖作为对照。

3.3 测定波长的选择

取显色后的对照品和供试品溶液在400～700nm 波长范围内扫描结果；表明显色后的最大吸收波长均在482nm， 若在该波长下测定空白溶液的吸收值大约为0.4 该实验结果与报道的实验结果一致[2-3]。然文献报道多用520nm 或550nm 波长测定，经实验结果表明以520nm 波长测定，无论新配试剂或是贮存试剂空白吸收值低（约0.04），且稳定故测定波长选用520nm。

3.4 线性关系考察

取在105℃ 干燥至恒重的葡萄糖对照品约50mg ，精密称定，置100ml 量瓶中加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取2、 3、 4 、5 、6、 7 、8ml 置10ml 量瓶中加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml ，自“精密加入DNS 显色液1.5ml” 起，依法操作。结果表明：参加反应的葡萄糖在100 ～420ug范围内，线性关系良好，相关系数为r=0.9999 （见表2 和图1 ）回归方程为y=-0.098+0.0018x

3.5 重现性考察

对同一批样品，分别取样6次，依法测定，结果见表3 ，结果表明本方法的重现性良好。

3.6 回收率考察

由于本测定方法是先将甘草多糖酸水解使之生成单糖，然后经证实其为葡萄糖后，再以葡萄糖为对照品进行测定，1 个分子的甘草多糖可以水解生成多少个分子的单糖目前尚不清楚。故在上述前提下，会通常使用回收率来考察，籍此来考察此方法是否适用于甘草多糖回收率的考察。使用本方法考察回收率，简单，有效，具体考察方法如下：精密称取甘草多糖对照品0.05g， 依本法测定并计算得多糖含量；再另精密称取甘草多糖对照品0.05g， 加到研细的制剂供试品0.10g （相当于正常含量测定取量的1/2 并已知标识含量）中，依法考察，由测得的多糖总量减去本底含量为测得的加入甘草多糖量，按下述公式计算回收率回，收率：100.8% ，RSD： 1.4% （n=6）

回收率% = [ 总糖含量-标识含量/ 加入多糖对照品量]×100%

4 样品的测定结果

按照含量测定方法分别对3批甘草多糖做了测定结果见表4。

5 结束语[4]

当前依据我国现行的质量标准，对含有多糖的药物或保健品的含量测定主要仍是以总糖指标加以控制为主，如银耳孢糖胶囊、纳豆胶囊、甘草胶囊等，本方法实际上是探求及考察将总糖指标控制变为多糖指标，实际可行性，并对日后保证和监控多糖类药品或保健品的质量具有实际的指导与应用价值。

参考文献

韩玉莲：植物中多糖的测定《中国食品卫生杂志》1995，7 （3），47-51

董文慧：云芝肝泰中云芝多糖的工业分析方法《中成药》1990，12（2），33-34

董文慧：分光光度法测定云芝肝泰中云芝多糖的含量《中国药科大学学报》1989， 20（3），175-178

张莉、李海生：3.5二硝基水杨酸比色法测定甘草多糖肠溶片中多糖的含量《天津市色谱学术交流会》 ， 2004endprint