TESTIN在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞系增殖、上皮-间质转化和侵袭转移的影响

刘新彦 李建斌 李志强 王丽坤 路继成 李晓丽 刘晓燕

·论著·

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2017.21.001

TESTIN在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞系增殖、上皮-间质转化和侵袭转移的影响

刘新彦 李建斌 李志强 王丽坤 路继成 李晓丽 刘晓燕

目的观察TESTIN在鼻咽癌组织和细胞中的表达，分析TESTIN过表达对鼻咽癌细胞增殖、上皮-间质转化(EMT)和侵袭转移的影响。方法采用免疫组化、Real time-PCR、Western-blot检测TESTIN在鼻咽癌组织和细胞系的表达状况。利用脂质体LipofectamineTM2000转染鼻咽癌5-8F细胞，Real time-PCR、Western-blot验证转染效率。MTT、细胞划痕实验、细胞侵袭实验检测TESTIN过表达对5-8F细胞增殖、EMT和侵袭转移的影响。Western-blot检测TESTIN过表达对侵袭转移相关基因表达的影响。结果TESTIN在鼻咽癌组织的阳性表达率和表达水平明显低于正常鼻咽部组织，差异有统计学意义(P<0.05)。与人正常永生化鼻咽上皮细胞系NP69比较，鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B中TESTIN表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。转染pcDNA3.1/TESTIN的5-8F细胞中TESTIN表达显著上调(P<0.05)。TESTIN过表达显著抑制5-8F细胞增殖、EMT和侵袭转移，同时上调E-cadherin表达，下调N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表达(P<0.05)。结论鼻咽癌组织和细胞系中TESTIN表达显著降低，TESTIN过表达可抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖、EMT和侵袭转移。

TESTIN；鼻咽癌；增殖；上皮-间质转化；侵袭转移

鼻咽癌是我国常见的头颈部恶性肿瘤，约占全部头颈部肿瘤的78%，具有起病隐匿、恶性度高、易转移和复发等特点[1-3]。目前，放化疗是治疗鼻咽癌的主要手段，但其对晚期已经出现复发和转移的患者疗效不佳，患者5年生存率不足60%，预后较差[4,5]。研究发现，上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)与肿瘤细胞侵袭转移密切相关，这是导致治疗失败的重要原因[6,7]。TESTIN基因定位于人染色体7q31.2，在正常组织大量表达，而在胃癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤组织和细胞系中几乎不表达或少量表达[8-10]。因此，TESTIN被认为是一个潜在的抑癌基因。然而，TESTIN在鼻咽癌细胞增殖、EMT和侵袭转移过程中的作用目前研究尚少。本研究观察TESTIN在鼻咽癌组织和5种细胞系的表达状况；采用pcDNA3.1/TESTIN转染鼻咽癌5-8F细胞，观察TESTIN过表达对5-8F细胞增殖、ETM及侵袭转移的影响，以期为以TESTIN为靶点探索鼻咽癌诊断和治疗的新方法提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河北北方学院附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科2013年2月至2016年5月鼻咽癌活检组织标本48例，均经病理确诊，未经任何放、化疗等抗癌治疗。其中男39例，女9例；年龄42～70岁，平均年龄(58.42±7.53)岁；高分化癌5例，中分化癌8例，低分化癌22例，未分化13例；出现淋巴结转移36例，未出现淋巴结转移12例。选取同期正常鼻咽部组织标本24例作为对照组。

1.2 试剂 人正常永生化鼻咽上皮细胞系NP69、鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B购自中科院典型培养物宝藏委员会细胞库；鼠抗人TESTIN多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；Trizol、LipofectamineTM2000转染试剂盒、RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司；Real time-PCR试剂盒购自美国Promega公司；免疫组化试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化:采用免疫组织化学SP法检测鼻咽癌组织及正常鼻咽部组织中TESTIN表达，以PBS代替一抗作为阴性对照，严格按照免疫组化试剂盒说明书操作。

1.3.2 细胞培养及转染:将人正常永生化鼻咽上皮细胞系NP69、鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B置于含胎牛血清和RPMI1640培养基中，于37℃、5% CO2条件下常规培养。当细胞融合达80%～90%时，胰酶消化细胞，以2×105/孔的密度接种于12孔板，利用脂质体LipofectamineTM2000转染 5-8F细胞。细胞分3组：未处理组(正常5-8F细胞)、阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1)、转染组(转染pcDNA3.1/TESTIN)。

1.3.3 Real time-PCR:按照Trizol试剂盒说明书提取鼻咽癌组织和对数生长期细胞总RNA，在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin为内参照基因，2-△△Ct法计算TESTIN基因相对表达水平。见表1。

表1 引物序列及扩增产物长度

1.3.4 Western-blot:采用RIPA裂解液提取对数生长期细胞总蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白经SDS-PAGE分离后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入鼠抗人TESTIN多克隆抗体，4℃孵育过夜。PBS洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，室温孵育1 h。PBS洗膜3次，以β-actin为内参照基因，ECL化学发光法检测TESTIN蛋白相对表达水平。

1.3.5 MTT实验:取对数生长期细胞接种于96孔板，调整细胞密度为5×103/孔，分别于第1、2、3、4、5天收集细胞，加入20 μl MTT溶液，4 h后弃去培养基加入150 μl DMSO，酶标仪490 nm波长处测定吸光度值(OD490)。

1.3.6 细胞划痕实验:取对数生长期细胞胰酶消化后以5×103/孔的密度接种于6孔板，用10 μl枪头做一垂直划痕，PBS洗3次。置于含1.5%胎牛血清的培养基中培养24 h，显微镜下观察并拍照。采用Image Pro Plus软件测量细胞迁移距离，重复3次，取均值。

1.3.7 细胞侵袭实验:将100 μl Matrigel胶铺于Transwell小室，取对数生长期细胞用无血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为1×106/ml，吸取0.2 ml细胞悬液加入Transwell小室的上室，将0.5 ml含10%胎牛血清的培养基加入Transwell小室的下室。培养24 h 后，取出小室，PBS清洗，用棉签蘸去滤膜上层未穿过的细胞和Matrigel胶，多聚甲醛固定细胞并染色，随机选取6个视野，200倍高倍镜下观察并记录穿膜细胞数，重复3次，取均值。

2 结果

2.1 TESTIN在对照组和鼻咽癌组的表达比较 免疫组化结果显示，TESTIN阳性表达主要表现为细胞质染成棕黄色或棕褐色。对照组、鼻咽癌组TESTIN阳性表达率分别为91.67%(22/24)、33.33%(16/48)，鼻咽癌组TESTIN阳性表达率明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Real time-PCR结果显示，对照组、鼻咽癌组TESTIN mRNA表达分别为(1.12±0.18)、(0.35±0.06)，鼻咽癌组TESTIN mRNA表达明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 TESTIN在对照组和鼻咽癌组的表达比较

注：与对照组比较,*P<0.05

2.2 TESTIN在NP69和5种鼻咽癌细胞系的表达比较 Real time-PCR和Western-blot结果显示，5种鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、C666-1、5-8F、6-10B中TESTIN mRNA和蛋白表达明显低于NP69细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，且在5-8F细胞系中表达最低。见表3。

2.3 TESTIN过表达的鼻咽癌5-8F细胞的鉴定 Real time-PCR和Western-blot结果显示，鼻咽癌5-8F细胞中TESTIN mRNA和蛋白表达明显高于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，未处理组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 TESTIN在NP69和5种鼻咽癌细胞系的表达比较

类别TESTINmRNATESTIN蛋白NP698．90±0．677．97±0．58CNE12．15±0．17∗2．00±0．15∗CNE22．63±0．35∗2．35±0．32∗5⁃8F 1．37±0．13∗1．01±0．10∗C666⁃12．04±0．19∗1．67±0．12∗6⁃10B1．92±0．23∗1．54±0．21∗

注：与NP69细胞比较,*P<0.05

表4 TESTIN过表达的鼻咽癌5-8F细胞的鉴定

组别TESTINmRNATESTIN蛋白未处理组 1．37±0．131．01±0．10阴性对照组1．39±0．15∗1．04±0．12∗转染组 5．41±0．89∗#5．23±0．80∗#

注：与未处理组比较,*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

2.4 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，转染组5-8F细胞生长速度明显低于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，未处理组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞增殖能力的影响

组别OD4901d2d3d4d5d未处理组 0．04±0．010．12±0．020．24±0．040．39±0．040．60±0．09阴性对照组0．03±0．010．11±0．01∗0．25±0．05∗0．38±0．05∗0．58±0．07∗转染组 0．04±0．010．07±0．01∗#0．15±0．03∗#0．26±0．04∗#0．40±0．06∗#

注：与未处理组比较,*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

2.5 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞形态的影响 在相差倒置荧光显微镜下观察鼻咽癌5-8F细胞形态变化，未处理组和阴性对照组的5-8F细胞大多呈长梭形的间质细胞形态，细胞间紧密连接疏松；而转染组5-8F细胞恢复成鹅卵石状上皮细胞形态，提示过表达能够逆转5-8F细胞EMT。

2.6 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验结果显示，转染组5-8F细胞迁移距离明显小于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，未处理组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞迁移能力的影响

组别迁移距离未处理组 17．25±2．56阴性对照组16．81±2．55∗转染组 5．12±0．35∗#

注：与未处理组比较,*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

2.7 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞侵袭能力的影响 细胞侵袭实验结果显示，转染组5-8F细胞穿过Matrigel胶的细胞数明显少于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，未处理组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞侵袭能力的影响 n=8，个

注：与未处理组比较,*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

2.8 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞EMT、侵袭转移相关基因表达的影响 Western-blot结果显示，转染组E-cadherin蛋白表达水平明显高于未处理组和阴性对照组，N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显低于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，未处理组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表8。

3 讨论

据统计，我国鼻咽癌发病率位居世界首位，该病主要好发于我国南方和东南亚地区，男性发病率高于女性，患者病死率高，预后极极差[11,12]。然而，临床诊断和治疗鼻咽癌仍缺乏有效手段。鼻咽癌发生发展是涉及多个基因、多种因素的复杂过程，其中癌基因和抑癌基因表达失衡是导致恶性肿瘤发生的重要机制。目前普遍认为抑癌基因表达下调或缺失在恶性肿瘤发生发展中可能发挥了较癌基因激活更为重要的作用。

表8 TESTIN过表达对鼻咽癌5-8F细胞EMT、侵袭转移相关基因表达的影响

组别E⁃cadherin蛋白N⁃cadherin蛋白Vimentin蛋白MMP⁃2蛋白MMP⁃9蛋白未处理组 0．37±0．051．15±0．161．23±0．201．11±0．181．20±0．16阴性对照组0．39±0．06∗1．12±0．14∗1．20±0．15∗1．08±0．14∗1．17±0．13∗转染组 1．08±0．15∗#0．39±0．06∗#0．35±0．04∗#0．29±0．04∗#0．23±0．03∗#

注：与未处理组比较,*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

人类TESTIN基因是Tatarelli等[13]于2000年首先发现和鉴定的癌症相关基因。TESTIN被发现以来，越来越多的研究表明其在多种恶性肿瘤组织表达缺失，并且与肿瘤发生及侵袭转移有关。Zhu等[14]通过体内外实验发现TESTIN在乳腺癌组织表达下调，而乳腺癌T47D细胞转染TESTIN基因后致瘤性明显下降，提示TESTIN可能作为抑癌基因在恶性肿瘤发生发展中发挥重要作用。然而，有关TESTIN在鼻咽癌中的作用目前研究尚少。

本研究首先采用免疫组化和Real time-PCR法观察TESTIN在鼻咽癌组织的表达状况，结果发现鼻咽癌组织TESTIN阳性表达率和表达水平均明显低于正常鼻咽部组织(P<0.05)，提示TESTIN可能与鼻咽癌发生及进展有关，TESTIN有可能成为治疗鼻咽癌的潜在靶点。为明确TESTIN的生物学功能及与鼻咽癌发生发展的关系，我们采用Real time-PCR和Western-blot法检测了鼻咽癌细胞系中TESTIN的表达状况，初步发现TESTIN在5种不同转移潜能鼻咽癌细胞中表达均显著下调，且在高转移性5-8F细胞系中表达水平最低。因此，我们推测TESTIN可能是调控鼻咽癌细胞转移的重要分子靶点。后续实验我们进一步采用基因转染技术上调TESTIN在鼻咽癌5-8F细胞的表达水平，通过MTT、细胞划痕实验、细胞侵袭实验观察TESTIN过表达对5-8F细胞增殖、EMT及侵袭转移的影响。本结果显示，TESTIN过表达显著抑制5-8F细胞增殖、EMT和侵袭转移，同时上调E-cadherin表达，下调N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9表达(P<0.05)，说明TESTIN参与了鼻咽癌细胞的侵袭转移过程，这与李戍军等[15]报道一致。

综上所述，鼻咽癌组织和细胞系中TESTIN表达显著下调，可能发挥抑癌基因作用，上调TESTIN表达能够明显抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖、EMT及侵袭转移过程。TESTIN有可能成为治疗鼻咽癌的潜在分子靶点。

1 Raab-Traubn.Nasopharyngeal carcinoma:an evolving role for the epstein-barr virus.Curr Top Microbiol Immunol,2015,390:339-363.

2 Chen W,Hu GH.Biomarkers for enhancing the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma.Cancer Biol Med,2015,12:23-32.

3 Chen ZT,Liang ZG,Zhu XD.A review:proteomics in nasopharyngeal carcinoma.Int J Mol Sci,2015,16:15497-15500.

4 Lee FK,Yip CW,Cheung FC,et al.Dosimetric difference amongst 3 techniques:tomo therapy,sliding-window intensity-modulated radiotherapy (IMRT),and rapid arc radiotherapy in the treatment of late-stage nasopharyngeal carcinoma (NPC).Med Dosim,2014,39:44-49.

5 Suarez C,Rodrigo JP,Rinaldo A, et al.Current treatment options for recurrent nasopharyngeal cancer.European archives of oto-rhino-laryngology:official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS):affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology. Head and Neck Sur,2010,267:1811-1824.

6 Guo W,You X,Xu D,et al.PAQR3 enhances twist 1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells.Carcinogenesis,2016,37:397-407.

7 Zhu X,Shen H,Yin X,et al.miR-186 regulation of twist 1 and ovarian cancer sensitivity to cisplatin.Oncogene,2016,35:323-332.

8 Sarti M,Sevignan IC,Calin GA,et al.Adenoviral transduction of TESTIN gene into breast and uterine cancer cell lines promotes apoptosis and tumor reduction in vivo.Clin Cancer Res,2005,11:806-813.

9 龙结根，张才全，赵林.TESTIN基因在结直肠癌组织中的表达及临床意义.中国癌症杂志，2009，19：428-432.

10 黄玮，翁德胜，潘志忠，等.TESTIN基因在原发性胃癌组织中的表达及临床意义.癌症，2008，27：984-988.

11 Hong JS,Tian J,Han QF,et al.Quality of life of nasopharyngeal cancer survivors in China.Curr Oncol,2015,22:e142-147.

12 何跃平，罗晶晶，刘钊，等.靶向livin 的siRNA对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响.中国免疫学杂志，2014，30：1028-1031.

13 Tatarelli C,Linnenbach A,Mimorik,et al.Characterization of the human TESTIN gene localized in the FRA7G region at 7q31.2.Genomics,2000,68:1-12.

14 Zhu J,Li X,Kong X,et al.Testinisa tumor suppressor and prognositic marker in breast cancer.Cancer Sci,2012,103:2092-2101.

15 李戍军，薛明学，韩璐荣.人鼻咽癌中Testin的表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，30：310-313.

ExpressionofTESTINinnasopharyngealcarcinomaanditseffectsontheproliferation,epithelial-mesenchymaltransition,invasionandmetastasisofnasopharyngealcarcinomacelllineinvitro

LIUXinyan*,LIJianbin,LIZhiqiang,etal.

*DepartmentofEarNoseThroatNeckSurgery,TheSecondHospitalAffiliatedtoHebeiNorthCollege,Hebei,Zhangjiakou075100,China

ObjectiveTo observe the expression of TESTIN in nasopharyngeal carcinoma (NPC),and to explore the effects of TESTIN overexpression on the proliferation,epithelial-mesenchymal transition (EMT),invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cell line in vitro.MethodsThe expressions of TESTIN in NPC tissue specimens and nasopharyngeal carcinoma cell line were detected by immunohistochemical assay,Real time-PCR,Western-Blot,respectively.After transient transfection of TESTIN into NPC cell line 5-8F by means of lipofectamine TM 2000,the expression of TESTIN was detected by Real time-PCR and Western-Blot.The effects of TESTIN overexpression on the proliferation,EMT,invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells were detected by MTT,cell scratching assay and cell invasion assay, respectively.Moreover the effects of TESTIN overexpression on the expression of genes related with invasion and metastasis were detected by Western-Blot.ResultsThe expression levels of TESTIN in NPC tissues were significantly lower than those in normal nasopharyngeal tissues (P<0.05).The expression levels of TESTIN in NPC cell line-CNE1, CNE2,C666-1,5-8F and 6-10B were significantly decreased,as compared with those in human normal immortalized nasopharyngeal epithelial cell line NP69 (P<0.05).However,the expression levels of TESTIN in 5-8F cells transfected by pcDNA3.1/TESTIN were significantly increased (P<0.05).The overexpression of TESTIN obviously inhibited the proliferation, EMT, invasion and metastasis of 5-8F cells,at the same time, which up-regulated the expressions of E-cadherin, however, which down-regulated the expressions of N-cadherin,Vimentin,MMP-2 and MMP-9 (P<0.05).ConclusionThe expression levels of TESTIN are significantly decreased in human NPC tissue and cell lines,moreover, TESTIN overexpression can inhibit the proliferation,EMT,invasion and metastasis of 5-8F cells.

TESTIN; nasopharyngeal carcinoma; proliferation;epithelial-mesenchymal transition;invasion and metastasis

R 766.3

A

1002-7386(2017)21-3205-04

2017-04-11)

项目来源:河北省医学科学研究重点课题计划项目(编号：20170181)

075100 河北省张家口市，河北北方学院附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科(刘新彦、王丽坤、李晓丽、刘晓燕)，病理科(李志强)；中国石油天然气集团公司中心医院耳鼻咽喉科(李建斌)；河北省张家口市宣化区人民医院检验科(路继成)