重组人胸腺素β4生物学活性测定方法的建立

徐宏伟，张俊英，马杉姗，汤晓闯，马素永，2，聂李亚，2，许松山，2

1.北京诺思兰德生物技术股份有限公司，北京 100085；2.北京市裸质粒基因治疗药物工程技术研究中心，北京 100085

技术方法

重组人胸腺素β4生物学活性测定方法的建立

徐宏伟1，张俊英1，马杉姗1，汤晓闯1，马素永1，2，聂李亚1，2，许松山1，2

1.北京诺思兰德生物技术股份有限公司，北京 100085；2.北京市裸质粒基因治疗药物工程技术研究中心，北京 100085

目的：建立适用于重组人胸腺素β4（rhTβ4）体外质量控制的生物学活性测定方法，用于该制品的生物学活性评价。方法：利用ECV304细胞迁移法，摸索细胞密度、玻连蛋白（Vn）浓度、rhTβ4浓度等影响因素，并对试验条件进行优化及方法验证。结果：细胞密度为0.5×104/孔、Vn浓度为12.5 μg/mL、rhTβ4浓度为200 nmol/L、孵育时间24 h和细胞迁移时间4 h时，细胞迁移率较高。结论：建立了rhTβ4生物学活性测定方法，该方法专属性强、重复性好、准确性高，可用于rhTβ4生物学活性测定。

重组人胸腺素β4；活性检测；细胞迁移

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一种在多种组织均有表达的多肽，广泛分布于各组织、器官和细胞中，作为哺乳动物细胞内一种主要的肌动蛋白调节分子，对受损组织的再生、重塑和愈合起重要作用[1-2]。研究表明，Tβ4具有多方面生物学活性，能够促进创伤区域表皮的细胞迁移、血管的生成和胶原沉积，具有消炎和促进创伤愈合的功效，在治疗皮肤、角膜创伤，心肌梗死，抗肿瘤等方面有着广阔的应用前景[3-5]。

目前Tβ4的制备方法有化学合成和基因工程两种，化学合成方法成本较高，而利用基因工程技术获得重组人Tβ4（recombinant human Tβ4，rhTβ4），并将其开发成为治疗用生物制品Ⅰ类新药，具有成本低、技术成熟、可大量生产等优势。

由于没有已上市品种的参照，因此需要从头建立rhTβ4的质量标准。作为质量标准中的重要指标，生物学活性检测方法的建立和优化尤为必要。文献报道的Tβ4活性检测方法多种多样：Tβ 4可促进多种细胞（如脐静脉血管内皮细胞、角膜上皮细胞及皮肤角化细胞）迁移；Tβ4具有促进血管生成的作用，可在E-玫瑰花结实验中观察其免疫活性[6-8]。本实验室在表达rhTβ4的基础上，建立、优化并验证了采用脐静脉血管内皮细胞测定rhTβ4生物学活性的方法，为rhTβ4的进一步药用开发奠定了坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

脐静脉血管内皮细胞ECV304和rhTβ4供试品由北京诺思兰德生物技术股份有限公司保存或制备。DMEM培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青工程材料有限公司）；玻连蛋白（vit⁃ronectin，Vn）（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；Transwell（孔径 8 μm）（Corning公司）。

1.2 细胞培养

采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养ECV304细胞，接种密度为1×104/孔，24 h后将培养液替换为不含胎牛血清的DMEM培养基进行饥饿培养过夜。弃掉培养液，加入新鲜的含5%胎牛血清和160 nmol/L rhTβ4的DMEM培养基培养24 h。

1.3 细胞迁移

用100 μg/mL Vn溶液包被24孔细胞迁移板并孵育2 h，弃上清，加入同体积的含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培养基，再用含0.1%BSA的DMEM培养基调整至适宜的细胞密度，将细胞加入Transwell的上室培养4 h。用95%甲醇/5%PBS固定5 min，然后擦除迁移孔内膜表面未迁移的细胞，染色5 min，漂洗干净。以细胞迁移指数（实验组迁移细胞数与对照组迁移细胞数的比值）来判定本品对细胞迁移的作用，选用光学显微镜低倍物镜（×4）选取细胞分布均匀的视野区域，再在20倍物镜下用目镜中附加的网格随机挑选5个视野（钟表圆心和3、6、9、12点位置）进行拍照，用IPP软件统计迁移细胞，取其平均值为该孔的计数结果。

1.4 细胞迁移中重要影响因素的筛选

对细胞密度、Vn浓度和rhTβ4浓度在细胞迁移中的影响进行筛选。分别设定细胞密度为5×104、1×104和 0.5×104/孔，Vn 浓度为 25、50 和 100 μg/mL，rhTβ4浓度为0、1.6、16和160 nmol/L，根据上述细胞迁移方法进行筛选。

1.5 细胞迁移试验条件的优化

采用L9（33）正交试验设计进行细胞迁移试验条件的优化，主要影响因素包括细胞密度、rhTβ4浓度和Vn浓度，每个因素分为3个水平，具体试验条件见表1。

表1 L9（33）正交试验因素水平表

1.6 专属性测定

根据前期实验结果，设定实验条件为细胞密度 0.5×104/孔、rhTβ4浓度 200 nmol/L、Vn浓度12.5 μg/mL、rhTβ4孵育时间24 h、细胞迁移时间4 h，进行方法学验证实验。考察成品辅料对rhTβ4活性的干扰，实验条件设置对照组、供试品组和成品辅料组，分别进行生物学活性测定。

1.7 重复性测定

选用与专属性测定同样的试验条件。将供试品分别采用3株细胞并在同样代次下重复检测3次，连续测定3个细胞代次，然后分别计算重复性检测结果的平均值和变异系数（CV）。具体实验设计如下：同时复苏3株细胞，分别传至第3代，进行批内3次重复性实验；取上述细胞的其中1支继续传代，分别于细胞的第4代和第5代进行批间3次重复性实验；不同批次的成品和原液分别测定3次；分别计算批内、批间重复性和不同样品的重复性检测结果的平均值和CV。

2 结果

2.1 细胞迁移中重要影响因素的筛选结果

2.1.1 细胞密度筛选结果 在细胞迁移试验中不同细胞密度的试验结果如图1所示。细胞密度为0.5×104/孔时，对照组和实验组的细胞迁移数目差异显著，而细胞密度为5×104/孔和1×104/孔时对照组和实验组差异不显著。

2.1.2 Vn浓度筛选结果 在细胞迁移试验中不同Vn密度的试验结果如图2所示。Vn浓度为25 μg/mL时，对照组和实验组的细胞迁移数目差异显著，而Vn浓度为100和50 μg/mL时对照组和实验组差异不显著。

2.1.3 rhTβ4浓度筛选结果 在细胞迁移试验中不同rhTβ4浓度的试验结果如图3所示。细胞迁移指数随rhTβ4浓度升高而增大，rhTβ4浓度为160 nmol/L时细胞迁移指数最大。

图1 不同细胞密度对细胞迁移数的影响

图2 不同Vn浓度对细胞迁移数的影响

图3 不同rhTβ4浓度对细胞迁移数的影响

2.2 细胞迁移试验条件优化结果

L9（33）正交试验设计优化了细胞密度、Tβ4浓度、Vn浓度等3个因素。细胞迁移指数试验结果见表2，在细胞密度为0.5×104/孔、rhTβ4浓度为200 nmol/L、Vn浓度为12.5 μg/mL时细胞迁移指数最高，达1.96±0.39。对3种影响因素的方差分析结果见表3，本试验的影响因素主次为rhTβ4浓度＞Vn浓度＞细胞密度。

2.3 专属性测定结果

结果显示，供试品组细胞迁移量为359±16，成品辅料组为148±10，对照组为152±19。成品辅料组和对照组的细胞迁移量差异不大，证明成品辅料对本试验无干扰，该方法专属性良好。

2.4 重复性测定结果

本试验批内、批间、原液和成品重复性测定结果见表4。不同批内、批间、原液和成品的细胞迁移指数均为1.61～1.72，细胞迁移指数的变异系数为3.63%～10.91%，均小于15%，提示本试验重复性较好。

表2 L9（33）正交试验结果

表3 方差分析表

表4 批内、批间、原液和成品检测重复性试验结果

3 讨论

我们建立了rhTβ4生物活性测定方法。研究结果表明，rhTβ4能够促进脐静脉内皮细胞的迁移，且在实验条件为细胞密度0.5×104/孔、Tβ4浓度 200 nmol/L、Vn浓度 12.5 μg/mL时，细胞迁移指数最高。与Kozaczuk等[6]的研究结果比较，rhTβ4使用浓度基本一致，但本试验降低了Vn浓度和细胞密度，而且采用肉眼观察的方法判定细胞迁移效果，采用计数法统计细胞迁移数量，计算细胞迁移指数，提高了结果判定的准确性。

本试验首先对细胞迁移试验中单个影响因素分别进行了筛选，并采用正交试验设计优化试验条件，初步建立了检测方法，在此基础上进一步进行了方法学验证。根据方法学试验结果可知，ECV304细胞迁移法检测rhTβ4生物学活性，操作简便，且专属性强、重复性好、准确性高。本试验结果为建立rhTβ4生物学活性测定的标准方法奠定了坚实的基础。

[1]张珍,游颜杰,李维娜,等.重组人胸腺素基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测[J].第四军医大学学报,2008,29(16):1451-1454.

[2]徐天娇,张昭,舒震,等.重组人胸腺素β4二串体蛋白的原核表达、纯化及生物活性[J].生物技术通讯,2012,23(3):329-332.

[3]李宪奎.人胸腺素β4在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定[D].北京:中国协和医科大学,2008.

[4]丁大有,马素永,许松山,等.胸腺素β4与药物开发[J].生命的化学,2012,32(1):67-70.

[5]刘羽佳,李集临.胸腺素β4研究进展[J].安徽农学通报,2010,16(4):38-44.

[6]Kozaczuk A,Selmi A,Bednarek R.Bacterial expres⁃sion,purification and angiogenesis-promoting activity of human thymosin β4[J].Protein Expr Purif,2013,90(2):142-152.

[7]Selmi A,Malinowski M,Brutkowski W,et al.Thymo⁃sin β4 promotes the migration of endothelial cells without intracellular Ca2+elevation[J].Exp Cell Res,2012,318(14):1659-1666.

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Development of a Biological Activity Detection Method for Recombinant Human Thymosin β4

XU Hong-Wei1,ZHANG Jun-Ying1,MA Shan-Shan1,TANG Xiao-Chuang1,MA Su-Yong1,2,NIE Li-Ya1,2,XU Song-Shan1,2*
1.Beijing Northland Biotech.Co.,Ltd.,Beijing 100085;2.Beijing Naked Plasmid Gene Therapy Drug Engineering Technology Research Center,Beijing 100085;China

Objective:To control the quality of recombinant human thymosin beta 4（rhTβ4）in vitro,the biologi⁃cal activity detection method was developed and evaluated.Methods:The ECV304 cell migration method was used to detect the biological activity of rhTβ4.The key factors including cell density,vitronectin（Vn） concentra⁃tion,rhTβ4 concentration were screened to establish the optimal migration conditions.Results:The highest cell mi⁃gration rate was observed under the conditions of the cell density 0.5×104/well,Vn concentration 12.5 μg/mL,rhTβ 4 concentration 200 nmol/L,incubation time 24 h and cell migration time 4 h.Conclusion:The developed biologi⁃cal activity detection method of rhTβ4 has high specificity,accuracy and repeatability,and it can be used for the quality control of rhTβ4.

recombinant human thymosin β4;biological activity detection;cell migration

Q502;Q24

A

1009-0002（2017）05-0661-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:xusongshan@northland-bio.com

2017-02-23

徐宏伟（1979- ），女，本科学历，（E-mail）xuhw0711@163.com

许松山，（E-mail）xusongshan@northland-bio.com