人ERK2基因对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响

韩笑，刘莹，梁迎春，闫志风，徐小洁，梁九思，洪甜，尤文叶，陈思禹，黄俊，叶棋浓，刘丹

1.锦州医科大学 附属第一医院，辽宁 锦州 121000；2.解放军总医院，北京 100853；3.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

人ERK2基因对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响

韩笑1,3，刘莹1，2，梁迎春3，闫志风2，徐小洁3，梁九思1，洪甜3，尤文叶2，陈思禹2，黄俊3，叶棋浓3，刘丹1

1.锦州医科大学 附属第一医院，辽宁 锦州 121000；2.解放军总医院，北京 100853；3.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

目的：构建携带Myc标签的人细胞外信号调节激酶2（ERK2）的真核表达载体，表达Myc-ERK2融合蛋白，检测其对人视网膜母细胞瘤细胞生长的影响。方法：采用PCR技术从乳腺文库中扩增人ERK2基因序列，将其插入pXJ-40载体；将重组质粒与空载体转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞系后，Western印迹检测表达情况，并进行生长曲线实验。结果：双酶切和测序鉴定表明Myc-ERK2真核表达质粒构建成功；转染WERI-Rb-1细胞后融合蛋白获得表达，生长曲线实验结果表明ERK2可促进肿瘤细胞的生长。结论：携带Myc标签的人ERK2基因的真核表达载体能在人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞中表达，且能促进该细胞的生长。本实验为进一步研究ERK2在肿瘤尤其是眼恶性肿瘤中的功能奠定了基础。

细胞外信号调节激酶2（ERK2）；真核表达；人视网膜母细胞瘤细胞

细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）成员之一[1-2]，其N端与C端相互卷曲形成一种典型的双叶结构的多肽链[3]。ERK家族有5个亚族，即ERK1、ERK2、ERK3、ERK4和 ERK5。对 ERK1和ERK2调节不同细胞内的减数分裂和有丝分裂等一系列生理活动的研究比较明确[4]。研究表明，血小板衍生生长因子（platelet derived growth fac⁃tor，PDGF）能通过ERK1/2信号通路影响视网膜色素上皮细胞的增殖和迁移[5]。ERK2还参与信号通路的激活和肿瘤的发生发展，可通过磷酸化底物蛋白调节细胞的生理功能，调控细胞周期、增殖、转录、分化、凋亡、迁移和黏附等功能，在恶性肿瘤的发生、转移和浸润等方面起重要作用[4,6]。因此，我们拟构建ERK2的真核表达载体，以便进一步研究ERK2与视网膜母细胞瘤的调控。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、人乳腺文库、真核表达载体pXJ-40为本实验室保存；VigoFect转染试剂、Western印迹发光检测试剂盒购自Vigorous公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR相关试剂购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒购自Promega公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM购自Gibco公司；胰酶购自Amersco公司；引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京奥科鼎盛生物技术有限责任公司完成。

1.2 ERK2基因的扩增

以人乳腺文库为模板，根据NCBI中的ERK2序列合成上游引物（5'-CCCAAGCTTATGGCGGC GGCGGCGGCGGC-3'）和下游引物（5'-CCGCTCG AGTTAAGATCTGTATCCTGGCTGGAATC-3'），PCR扩增ERK2序列（扩增条件：预变性95℃ 5 min；变性95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸72℃ 50 s，30个循环；再延伸72℃ 7 min）。使用高保真PfuDNA聚合酶，扩增产物于4℃保存，用胶回收试剂盒回收。

1.3 重组表达质粒的构建与鉴定

用BamHⅠ/HindⅢ双酶切pXJ-40载体，37℃，4 h，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamHⅠ/HindⅢ双酶切，暴露出酶切位点的粘性末端，用T4DNA连接酶连接入pXJ-40载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，振荡培养并提质粒，用BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送北京奥科鼎盛生物技术有限责任公司测序。

1.4 细胞转染和Western印迹检测

按常规实验方法转染。用含双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基将HEK293T细胞接种于6 cm皿中，接种量以转染时细胞密度达80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。将4 μL VigoFeet与 200 μL NaCl混合，室温静置 5 min，再将总量为10 μg的重组质粒Myc-ERK2与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿中，并以同样方法转染空载体作为对照，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，4～6 h更换为正常DMEM培养液，24 h后收集细胞，加入RIPA裂解液冰浴30 min，加入等量的2×SDS缓冲液，煮沸15 min，12 000 r/min离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜，随后用5%脱脂奶粉以1∶1000稀释HRP标记的抗Myc标签鼠单克隆抗体进行孵育，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.5 生长曲线实验

将Myc-ERK2和空载体转染WERI-Rb-1细胞，48 h后取处于对数生长期的细胞，计数后稀释至2×104/L，分别接种于5个96孔板，各设3个重复孔，常规培养。每日取一块96孔板，在接种孔内用排枪加入10 μL CCK-8溶液，37℃放置1～4 h，在波长450 nm处测定样品D值。

2 结果

2.1 人ERK2基因的克隆

以人乳腺文库为模板扩增ERK2基因，获得约1080 bp的PCR产物，与预期一致（图1）。

图1 ERK2基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 Myc-ERK2重组质粒的构建与鉴定

将PCR产物双酶切后与pXJ-40载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆提质粒进行双酶切鉴定，凝胶电泳可见约1080 bp的条带（图2），表明ERK2序列已成功插入Myc标签中。测序结果显示与已知序列完全一致，从而证明重组质粒Myc-ERK2构建成功。

图2 Myc-ERK2重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳图

2.3 Western印迹检测融合蛋白的表达

将构建的重组质粒Myc-ERK2和空载分别转染HEK293T细胞，4～6 h后更换为DMEM完全培养液，24 h后提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE，

图3 Western印迹检测融合蛋白Myc-ERK2的表达

2.4 生长曲线检测ERK2表达对WERI-Rb-1细胞生长的影响

图4 ERK2能促进WERI-Rb-1细胞的生长

为了探讨WERI-Rb-1细胞中ERK2活性对其增殖是正调控还是负调控，用CCK8试剂盒检测ERK2对WERI-Rb-1细胞生长的影响。结果证明ERK2能促进WERI-Rb-1细胞的生长（图4）。Western印迹检测Myc-ERK2蛋白的表达。结果显示，转染重组质粒Myc-ERK2后，在相对分子质量约43 000处可见明显的特异性条带，而转染空载体后则无条带，表明重组蛋白Myc-ERK2能在HEK293T细胞中正确表达（图3）。

3 讨论

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是一种起源于视网膜胚胎性的眼内恶性肿瘤，多发于婴幼儿，发病率为1∶15 000，近年来仍有逐渐上升趋势。血-视网膜屏障（blood-retina barrier，BRB）由内层BRB（inner BRB，IBRB）及外层BRB（outer BRB，OBRB）组成，在维持视网膜内环境稳定方面起非常重要的作用[7-9]。ERK是一类丝/苏氨酸蛋白激酶[10]，ERK通路在MAPK通路中起重要作用。MAPK通路由Ras/Raf/MEK/ERK通路组成，其信号的传导遵循MAKP的三级联体系，即MAPK、MAPK激酶（MAPK kinase，MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKK kinase，MAPKKK），激活顺序依次为：MAPKKK激活MAPKK，MAPKK激活MAPK，活化后的MAPK进入细胞核，导致细胞核内转录的激活[11-12]。研究表明，阻断小鼠体内ERK信号传导通路，可以减少缺氧条件下OBRB的被破坏[13]。视网膜缺血和再灌注广泛参与眼部疾病，引起视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）死亡，导致视觉障碍和失明[14]。Gao等研究发现，p-ERK蛋白抑制ERK活性上调对缺血性脑损伤和损伤RGC有明显的保护作用[15]。同时，ERK通路的异常与恶性肿瘤的发生发展也密切相关。研究表明ERK2的活化可改变细胞病理性增殖，雌激素可通过对ERK2通路的影响来抑制动脉平滑肌细胞的增殖[16]。在肾脏中，ERK2通路参与急性肾衰竭的炎症反应可导致肾小管上皮细胞凋亡增加和炎性标记物增加[17]。在乳腺癌中，ERK2的过表达促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[18]。在肝癌中，ERK2的活化和过表达可增强肝癌细胞的迁移能力[19]。因此，研究ERK2有助于明确肿瘤细胞的增殖和凋亡机制及对肿瘤发生发展的影响，进而指导肿瘤的治疗和新药的研制。

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Effect of HumanERK2Gene on Growth of Human Retino⁃blastoma WERI-Rb-1 Cells

HAN Xiao1,3,LIU Ying1,2,LIANG Ying-Chun3,YAN Zhi-Feng2,XU Xiao-Jie3,LIANG Jiu-Si1,HONG Tian3,YOU Wen-Ye2,CHEN Si-Yu2,HUANG Jun3,YE Qi-Nong2*,LIU Dan1*
1.The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;2.Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;China

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of human extracellular signal regulated ki⁃nase 2（ERK2） labeled with Myc and detect its expression and activity in human retinoblastoma cells.Methods:Human ERK2 coding region was amplified from human mammary cDNA library by PCR and cloned into pXJ-40 vector.The recombinant plasmid Myc-ERK2 was transfected into human WERI-Rb-1 cells and the expression was detected by Western blot.The proliferation of WERI-Rb-1 cells was examined by growth curve experiment.Results:Myc-ERK2 eukaryotic expression vector was constructed and verified by double enzyme digestion and nu⁃cleic acid sequencing.Human ERK2 protein was expressed in human WERI-Rb-1 cells as was shown by West⁃ern blot results and ERK2 protein promoted the proliferation of WERI-Rb-1 cells.Conclusion:The Myc-ERK2 was identified to promote WERI-Rb-1 cell proliferation,which is a fundamental study for ERK2's role in retinob⁃laastoma.

human extracellular signal regulated kinase 2（ERK2）;eukaryotic expression;human retinoblastoma cells

Q78

A

1009-0002（2017）05-0610-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Dan,E-mail:docliu61@163.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com

2017-04-27

国家自然科学基金（81672602，81472589，81502264）；北京市科技新星计划（Z141102001814055）；军事医学科学院创新基金转化医学项目（ZHYX003）

韩笑（1989- ），女，硕士研究生，（E-mail）hanxiao9910@sina.com；刘莹（1981- ），女，博士研究生，（E-mail）liuying5322@163.com；梁迎春（1979- ），女，博士研究生，（E-mail）lyc.513@163.com；三者为共同第一作者

刘丹，（E-mail）docliu61@163.com；叶棋浓，（E-mail）yeqn66@yahoo.com