mB7H4-Ig融合蛋白对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损的干预作用①

王祈璋 吴祯祥 詹宏量 钱艺芳 刘 英 张秋玉

(福建医科大学免疫治疗研究所，临床医学部，福州 350108)

mB7H4-Ig融合蛋白对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损的干预作用①

王祈璋 吴祯祥 詹宏量 钱艺芳 刘 英 张秋玉

(福建医科大学免疫治疗研究所，临床医学部，福州 350108)

目的探讨mB7H4-Ig融合蛋白对咪喹莫特诱导小鼠银屑病的干预作用。方法ELISA法测定高压注射重组质粒在体内的表达水平；用咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型，治疗组高压注射mB7H4-Ig质粒而对照组注射Flag-Ig质粒，HE染色检测皮损改变，流式细胞术测定外周血免疫细胞亚群比例。结果高压注射后小鼠体内可表达mB7H4-Ig融合蛋白；与对照组小鼠相比，治疗组小鼠皮肤的银屑病皮损炎症症状及病理改变相对较轻，PASI 分数降低，外周血中的中性粒细胞比例明显降低而CD4+T细胞比例上调。结论mB7H4-Ig融合蛋白通过抑制炎症反应因而改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病皮损病变，有望成为治疗银屑病新策略。

B7H4；银屑病；咪喹莫特；中性粒细胞；T细胞

银屑病是常见的四大顽固性皮肤病之一，近年的研究资料表明，该疾病是一种主要由T细胞及中性粒细胞等炎症细胞所介导的自身免疫性疾病[1,2]。B7同源体4(B7 homology 4，B7-H4)是2003年由Sica等[3]先后发现的B7家族的新成员，又称B7S1、VTCN1(V set domain-containing T cell activation inhibitor)，属于免疫负调控分子[4]。类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的血清中可检测到高水平的可溶性B7H4蛋白，膜型mB7H4-Ig蛋白具有抑制中性粒细胞发育及抑制T细胞增殖的作用而发挥免疫负调控作用[5,6]。有关B7H4与银屑病相关的研究尚未见报道。鉴于银屑病亦是自身免疫性炎症性疾病，本项目拟观察mB7H4-Ig融合蛋白对银屑病模型的干预作用及作用机制，旨在为临床治疗银屑病提供的新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 8周龄雌性 BALB/c小鼠，体重20～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证号为SCXK(沪)2012-0002]，饲养于SPF级动物室，实验动物伦理审查号为2017-031。

1.1.2主要试剂 咪喹莫特乳膏(含5% IMQ)购自珠海联邦制药股份有限公司；凡士林乳膏为Unilever公司产品；PEI转染试剂、DMEM及细胞培养基添加剂均购自Sigma公司；去内毒素质粒大抽提试剂盒购自QIAGEN公司；纯化融合蛋白的Protein A柱购自GE公司；SDS-PAGE相关试剂购自Bio-Rad公司；HE染色试剂购自碧云天生物有限公司；流式抗体、HRP标记的链霉亲和素及TMB购自ebiosience公司；HRP-anti mouse IgG抗体及ECL显影剂均购自CST公司；293T细胞为本室保存；mB7H4-Ig表达质粒及对照质粒Flag-Ig、mB7H4-hIg重组蛋白、小鼠B7H4单克隆抗体(6H3、4M5)均由耶鲁大学癌症研究中心陈列平教授赠送。

1.2方法

1.2.1免疫印迹法鉴定mB7H4-Ig融合蛋白的表达及纯度 mB7H4-Ig及Flag-Ig重组质粒经转化、阳性菌扩增培养后用去内毒素质粒大抽提试剂盒抽提;参照PEI转染试剂的说明，将含有mB7H4胞外段和mIg2a-Fc基因融合拼接的重组质粒(mB7H4-Ig)转染293T细胞，5 d后收集10 ml培养上清经Protein A柱纯化，获取mB7H4-Ig融合蛋白；纯化蛋白加入含有或不含DTT的上样缓冲液煮沸裂解，10% SDS-PAGE凝胶电泳及转膜后，用抗B7H4的6H3单克隆抗体(1∶2 500)孵育过夜，次日加入HRP-anti mouse IgG二抗(1∶2 000)，ECL显影并拍照。

1.2.2ELISA法分析高压注射重组质粒后血清中mB7H4-Ig水平 BALB/c 小鼠10只分成2组，通过尾静脉分别高压注射2种质粒[30 μg/(2 ml·只)]，注射后第3、6、9、12天眼眶后静脉丛取血，ELISA法分析血清中B7H4-mIg融合蛋白的表达水平：用抗mB7H4的6H3单克隆抗体包被ELISA板(2 μg/ml)4℃过夜，次日洗涤后加入1%BSA室温封闭1 h，洗涤后加入 mB7H4-hIg重组蛋白(标准品，1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、0 ng/ml)及待测血清37℃孵育2 h，洗涤后加入生物素标记的抗mB7H4的4M5单克隆抗体(检测抗体)37℃孵育1 h，洗涤后加入HRP标记的链霉亲和素室温孵育1 h，加入TMB显色，2 mol/L H2SO4终止反应,酶标仪450 nm处读取OD值。

1.2.3小鼠银屑病模型的构建及质粒高压注射 BALB/c小鼠30只随机分3组，对照组、模型组及治疗组各10只。将小鼠麻醉后，刮除其背部毛发，形成约2 cm ×3 cm大小的暴露区域，在剃毛区域涂抹咪喹莫特乳膏(含IMQ 5%)，剂量为62.5 mg/(只·d)；空白组使用等量凡士林乳膏；连续涂抹12 d。在建模前一天模型组和对照组进行mB7H4-Ig及Flag-Ig重组质粒的高压注射，建模第5天每组取4只小鼠做皮损区HE染色分析，同时取外周血做流式染色分析；其余小鼠继续观察皮损进展情况。

1.2.4小鼠的PSAI评分 参照文献[7]，观察上述各组皮损的变化情况，进行小鼠的银屑病样皮损面积和疾病严重程度(Psoriasis area and severity index,PASI)的评分，依据PASI 评分标准对各组小鼠皮损的红斑、鳞屑及浸润增厚程度进行积分估计(0～4分)，将三者积分相加得到总积分。

1.2.5小鼠涂药皮肤的病理切片HE染色分析 小鼠脱颈处死后，按照九格法各组剪取涂抹区皮肤，经10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋及切片，HE常规染色，光镜下观察并拍照。

1.2.6流式分析法检测外周血免疫细胞比例 各组小鼠外周血经红细胞裂解及洗涤后，加入荧光标记抗体(FITC anti-CD11b、PE anti-CD4、APC anti-Gr-1、V450 anti-CD8)4℃孵育30 min，在BD Verse流式细胞仪进行检测分析。

2 结果

2.1mB7H4-Ig重组质粒转染、表达及纯化 将含有mB7H4胞外段和mIg2a-Fc基因融合拼接的重组质粒(mB7H4-Ig)转染293T细胞，收集培养上清经Protein A柱纯化后获取mB7H4-Ig融合蛋白。免疫印迹结果显示(见图1)，未经DTT处理的目的蛋白分子量在50～150 kD之间，比融合蛋白理论值(52.2 kD)稍大，推测是由于该蛋白形成二聚体、多聚体所致；经DTT处理去除二硫键后，目的蛋白分子量约50 kD，与预期的分子量相符。经估算细胞培养上清中目的蛋白分泌量约在0.01 mg/ml左右。

2.2mB7H4-Ig重组质粒高压注射后血清中mB7H4水平 如图2所示：A图为以mB7H4-hIg纯化蛋白作为标准品，利用结合不同位点的两株抗mB7H4单克隆抗体6H3及4M5(生物素标记)分别作为包被和检测抗体，通过双抗体夹心ELISA法绘制的标准曲线，拟合曲线方程为Y=489.4X-86.04(r=0.959 1)；B图为高压注射mB7H4-Ig及 Flag-Ig的重组质粒不同时间后血清中mB7H4-Ig融合蛋白的表达水平，可见注射后的第1天即开始表达并达到最高水平，随着时间增加，表达水平逐渐降低，第12天几乎检测不到蛋白的表达；而高压对照组(Flag-Ig)未检测到mB7H4蛋白的表达。结果表明，mB7H4-Ig重组质粒高压注射可在小鼠体内获得表达并释放到血清中。

2.3mB7H4-Ig质粒高压注射对银屑病小鼠皮损症状的影响 在建模前一天进行高压注射mB7H4-Ig融合蛋白及无关蛋白Flag-Ig的重组表达质粒，随后观察涂药区域皮损变化。如图3所示，空白组(Vaseline)涂药区域皮肤无明显变化，而咪喹莫特(IMQ)涂药区域皮肤在第3天皮肤出现红斑、鳞屑、增厚等典型的银屑病样皮损，第5天症状最严重，第8天皮损改变开始自行消退。与对照组(IMQ-Flag-Ig)相比，治疗组(IMQ-mB7H4-Ig)小鼠的皮肤受损症状较轻且消退较早，PASI评分尤其是浸润增厚程度评分显著降低(见图4C)，提示mB7H4-Ig融合蛋白具有抑制咪喹莫特诱导小鼠银屑病皮损的作用。

图1 免疫印迹法鉴定mB7H4-Ig融合蛋白Fig.1 Analysis of purified mB7H4-Ig fusion protein by Western blotNote:M.Standard protein marker；1.Denatured fusion protein；2.Undenatured fusion protein.

图2 重组质粒高压注射后小鼠血清中mB7H4水平Fig.2 Level of mB7H4 in mouse sera after hydrodynamic injection of recombinant plasmidsNote:A.Sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established to estimate mB7H4 fusion protein concentrations (left);B.The level of mB7H4 in mouse sera was examined on day 3,6,9,12 after tail vein hydrodynamic injection of recombinant mB7H4-Ig or Flag-Ig plasmids (right).

2.4各组小鼠涂药区皮肤HE染色结果 在建模第5天处死小鼠，取涂药区皮肤进行HE染色，结果如图5所示：空白组小鼠的皮肤表皮较薄，仅 2～3层，细胞形态正常；而IMQ处理的小鼠涂药区皮肤可见表皮层明显增厚、角化不全、新生血管增多、颗粒层减少和棘层肥厚、炎性细胞浸润增多等银屑病皮肤病理特征；与对照组相比，mB7H4-Ig高压注射的治疗组表皮层厚度降低、角化不全减少、炎症细胞浸润及血管增生扩张等均有所减轻。由此可见，mB7H4-Ig融合蛋白具有缓解咪喹莫特诱导银屑病样皮损症状的作用。

2.5mB7H4-Ig高压注射对银屑病小鼠外周血免疫细胞亚群比例的影响 在建模第5天取各组小鼠外周血进行流式染色分析。结果显示：与空白组(Vaseline)相比，咪喹莫特(IMQ)涂药组小鼠外周血细胞中的中性粒细胞(CD11b+Gr-1+)比例明显增高(P=0.000 8)，CD4+T细胞比例明显减少(P=0.001 2)，而单核细胞(CD11b+ly6C+)及CD8+T的比例差异不显著(见表1)。有意义的是，与对照组(IMQ-Flag-Ig)相比，治疗组(IMQ-mB7H4-Ig)小鼠外周血中的中性粒细胞比例升高幅度降低 (P=0.009)且CD4+T细胞比例略有上升(P=0.013 2)(表1，图6)。这一结果说明，mB7H4-Ig融合蛋白可通过降低咪喹莫特诱导的炎症细胞尤其是中性粒细胞的浸润而减轻皮损的症状。

图3 重组质粒高压注射后建模小鼠皮损症状变化Fig.3 Morphology of mouse skin after hydrodynamic injection of recombinant plasmidsNote:The gross observation of mouse lesional skin in different groups on day 3,day 5 and day 8. Vaseline:BALB/c mice were treated with vaseline as control; IMQ-mB7H4-Ig:BALB/c mice were treated with IMQ after hydrodynamic injection of mB7H4-Ig plasmids; IMQ-Flag-Ig:BALB/c mice were treated with IMQ after hydrodynamic injection of Flag-Ig plasmids.

图4 重组质粒高压注射后各组小鼠的皮损PASI评分Fig.4 PASI scores of mouse skin lesion induced by IMQ after hydrodynamic injection of recombinant plasmidsNote:Scores of mouse skin lesions induced by IMQ. Erythema (A),scaling (B) and thickness (C) were scored daily on a scale from 0 to 4,then the cumulative scores (D) were calculated. The scores were expressed as the Mean±SEM,n=6.

图5 重组质粒高压注射后各组小鼠涂药区HE染色变化Fig.5 Hematoxylin eosin staining of mouse skin after hydrodynamic injection of recombinant plasmidsNote:HE staining of IMQ induced mouse skin lesions in different groups on day 5. Psoriasis-like lesions were characterized by increased vascularization (circles),inflammatory cell infiltration (arrows) and epidermal hyperplasia (double arrows). Vaseline:BALB/c mice were treated with vaseline as control; IMQ-mB7H4-Ig:BALB/c mice were treated with IMQ after hydrodynamic injection of mB7H4-Ig plasmids; IMQ-Flag-Ig:BALB/c mice were treated with IMQ after hydrodynamic injection of Flag-Ig plasmids.,×200 magnification (left),×400 magnification (right).

表1 重组质粒高压注射后各组小鼠外周血免疫细胞亚群比例变化

Note：Vaseline vs IMQ-Flag-Ig，1)P<0.000 1,2)P<0.001；IMQ-Flag-Ig vs IMQ-mB7H4-Ig，3)P<0.001,4)P<0.05. The percentages were expressed as the Mean±SEM,n=4.

图6 重组质粒高压注射后各组小鼠外周血流式细胞术分析结果Fig.6 Flow cytometric analysis of murine peripheral blood after hydrodynamic injection of recombinant plasmidsNote:The proportion of CD11b+ Gr-1+ neutrophils in peripheral blood derived from different groups mice was analyzed by flow cytometry and analysis gates set on the lymphocytes (left);The proportion of CD4+ T,CD8+ T cells in peripheral blood was analyzed by flow cytometry and analysis gates set on CD45+ cells (right).

3 讨论

银屑病是一种常见的以表皮增殖和炎症为特征的红斑鳞屑性慢性炎症性皮肤病。随着对其发病的免疫机制研究的不断深入,多数研究者认为T细胞介导的免疫应答在银屑病皮损的发生及持续存在中起到了重要的作用。在银屑病皮损局部可测到大量活化T细胞的浸润，活化CD4+Th1细胞亚群通过释放IFN-γ、TNF-α等的细胞因子加重局部的炎症作用，后者通过促进角质形成细胞的增殖及抑制其发生凋亡而促进银屑病表皮细胞增生[8]。近年来，CD4+Th17及其释放的细胞因子IL-17被视为银屑病发病的关键性细胞亚群和细胞因子[9-11]。由于银屑病存在着多种免疫学异常表现，抗TNF-α、IL-17A抗体等靶向活化T细胞的药物在银屑病临床试验中显现一定的疗效[12，13]。

Chen课题组最早提出B7H4分子是一个重要的免疫负调控因子，具有抑制T细胞增殖的作用[3]；随后，在李斯特菌感染的小鼠模型中发现，mB7H4-Ig融合蛋白可显著抑制骨髓中中性粒细胞前体细胞的生成、增殖和吞噬能力[6]；在胶原诱导的小鼠关节炎模型中发现，高压注射带有mB7H4胞外段和mIg2a-Fc基因融合拼接的重组质粒(mB7H4-Ig)具有抑制小鼠关节炎症进展的作用。鉴于银屑病是一种中性粒细胞及T细胞浸润的自身免疫性炎症性疾病，我们推测B7H4-Ig融合蛋白可能具有缓解银屑病临床病变的作用。本研究通过构建咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损的模型，探讨外源性mB7H4-Ig融合蛋白对银屑病的干预作用及其可能的作用机制。

首先，我们将含有mB7H4胞外段和mIg2a-Fc基因融合拼接的重组质粒(mB7H4-Ig)转染293T细胞，Protein A柱纯化获得融合蛋白。但该融合蛋白在293T细胞中表达量有限，无法满足体内实验的需求。随后，我们通过尾静脉高压注射mB7H4-Ig重组质粒取代融合蛋白的直接注射。结果显示，高压注射法可诱导体内表达mB7H4-Ig融合蛋白(见图2)。选择咪喹莫特作为构建小鼠银屑病模型的诱导剂，涂药3 d后即可在涂药区域观察到红斑、鳞屑、皮肤增厚等典型银屑病改变，表明模型成功建立(见图3)。在涂药前一天高压注射mB7H4-Ig重组质粒进行治疗，治疗后小鼠银屑病样皮损症状略缓解。PASI评分结果显示，mB7H4-Ig重组质粒干预组小鼠皮损的红斑、鳞屑、皮肤增厚等评分均低于对照组。HE染色显示，治疗组皮损局部中性粒细胞等炎症细胞浸润、血管增生、表皮增厚等银屑病的病理改变均较对照组显著减轻(见图5)。上述结果表明，mB7H4-Ig融合蛋白对银屑病皮损有一定的干预作用。流式细胞分析显示，治疗组外周血中性粒细胞的比例显著低于对照组。新近有研究表明，中性粒细胞可以分泌产生胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps，NET)促进炎症反应，参与多种疾病自身免疫性损伤[14]。由此，我们推测，mB7H4-Ig融合蛋白可通过抑制中性粒细胞的生成或抑制其向皮损局部迁移或活化等机制而减轻银屑病小鼠皮损症状及病理表型的改变，该结果与Zhu等报道mB7H4-Ig融合蛋白抑制中性粒细胞活化的结果一致[6]。

有趣的是，我们还观察到咪喹莫特诱导的小鼠外周血淋巴细胞比例尤其是CD4+T细胞的比例显著低于凡士林诱导组，mB7H4-Ig重组质粒高压后外周血CD4+T细胞的比例有所提高。已知，咪喹莫特是Toll样受体7激动剂(TLR7 agonist)。有的研究报道，咪喹莫特可结合皮肤Langerin(neg)常规型树突状细胞(Conventional dendritic cells)上TLR7受体，继而促进DC的活化并释放大量IL-23，IL-23可促进Th17细胞的分化及释放IL-17，IL-23/IL-17轴是咪喹莫特的诱导小鼠皮肤发生银屑病样炎症级联反应的重要因素[15]。2015年，Ramirez-Valle等[16]报道，咪喹莫特诱导的银屑病模型皮肤局部存在一群Vγ4+γδT细胞，这群细胞具有记忆性T细胞的特征，IMQ再次诱导后可迅速活化并大量释放IL-17A、IL-1β等炎症因子，是介导银屑病样炎症的主要细胞。我们的研究发现，伴随着皮损炎症的减轻，mB7H4-Ig治疗后第5天及第8天小鼠外周血CD4+T细胞比例增高并接近未造模小鼠，而皮损局部浸润的细胞比例亦显著降低。因此，我们推测，造模后小鼠外周血CD4+T细胞的减少可能是CD4+效应T细胞向皮损局部迁移所致，mB7H4-Ig减少效应T细胞向皮损局部浸润导致外周血CD4+T细胞比例略回升。后期研究将进一步明确mB7H4-Ig作用的T细胞亚群及对炎症性细胞因子表达水平的影响。

总之，本研究率先尝试将mB7H4-Ig融合蛋白用于治疗小鼠银屑病皮损。结果表明，高压注射B7H4-Ig融合蛋白可通过抑制中性粒细胞及CD4+T细胞的浸润而达到减轻银屑病皮损局部的炎症病变。该研究结果为寻找临床治疗银屑病的新靶点和新策略提供一定的理论基础。

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[收稿2017-04-28 修回2017-06-20]

(编辑 倪 鹏)

EffectofmB7H4-Igfusionproteinonmousepsoriasis-likelesionsinducedbyimiquimod

WANGQi-Zhang,WUZhen-Xiang,ZHANHong-Liang，QIANYi-Fang，LIUYing,ZHANGQiu-Yu.
InstituteofImmunotherapy,SchoolofClinicalMedicine，FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108，China

Objective:To explore the effects of mB7H4-Ig fusion protein on mouse psoriasis-like lesions induced by imiquimod(IMQ).MethodsThe level of mB7H4-Ig fusion protein was detected by ELISA after hydrodynamic injection of recombinant plasmids.The therapeutic groups were injected with mB7H4-Ig plasmids and control groups were injected with Flag-Ig plasmids following IMQ treatment.5 days after treatment,the skin lesions were determined by hematoxylin-eosin staining and the percentage of immune cells in murine peripheral blood cells was measured by flow cytometric analysis.ResultsThe expression of mB7H4-Ig fusion protein was detected in mouse sera after hydrodynamic injection.Compared with control groups,mB7H4-Ig groups were alleviated,with decreased epidermal inflammation and lower PASI scores.The percentage of neutrophils in peripheral blood was reduced significantly in mB7H4-Ig groups,but the percentage of CD4+T cell was increased.ConclusionmB7H4-Ig fusion protein improved imiquimod induced psoriasis-like lesions by inhibiting the inflammatory response,indicating the potential therapeutic strategy of B7H4-Ig fusion in psoriasis.

B7 homology 4；Psoriasis;Imiquimod;Neutrophil;T cell

①本文为福建省自然科学基金(2017J01525)和福建省大学生创新创业训练计划项目(201610392058)。

R392.12

A

1000-484X(2017)10-1509-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.014

王祈璋(1995年-)，男，主要从事临床医学方面研究，E-mail：837490042@163.com。

及指导教师：张秋玉(1974年-)，女，医学博士，副教授，硕士生导师，主要从事自身免疫、肿瘤免疫方面研究，E-mail：qiuyu.zhang@fjmu.edu.cn。