NETs刺激下慢性支气管炎大鼠血清ANCA产生机制探讨①

李 慧 邢广群

(青岛大学附属医院肾病科，青岛 266555)

NETs刺激下慢性支气管炎大鼠血清ANCA产生机制探讨①

李 慧 邢广群

(青岛大学附属医院肾病科，青岛 266555)

目的探讨长期慢性感染刺激诱导机体产生抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的机制。方法烟熏法联合脂多糖气管内注入，建立慢性支气管炎大鼠模型，用佛波脂(PMA)体外刺激大鼠中性粒细胞产生中性粒细胞胞外网络(NETs)，以NETs免疫慢性支气管炎大鼠，比较慢性支气管炎NETs刺激组(CB/NETs)、慢性支气管炎组(CB)和正常组三组大鼠血清髓过氧化物酶-抗中性粒细胞胞浆抗体(MPO-ANCA)、血清瓜氨酸化的组蛋白H3(CitH3)、血清IFN-α水平及血清肌酐、血清尿素氮、尿红细胞计数、24 h尿蛋白定量水平。结果(1)CB/NETs组的血清MPO-ANCA水平明显高于CB组及正常组，(62.497 5±19.637 64)ng/ml vs(17.380 6±4.886 49)ng/ml，(20.888 4±4.396 07)ng/ml(P<0.01)。(2)CB/NETs组的血清CitH3水平明显高于CB组及正常组，(32.597 4±20.291 5)ng/ml vs (8.856 8±2.366 92)ng/ml，(5.622 5±0.837 38)ng/ml，(P<0.05，P<0.01)。(3)CB/NETs组中有两只大鼠的血清IFN-α水平异常升高(3 735.7、3 428.4 pg/ml)。(4)三组大鼠的肾脏相关指标差异暂未呈现出统计学意义。(5)大鼠血清CitH3水平与血清MPO-ANCA水平呈正相关(r=0.61，P<0.05)。结论慢性支气管炎长期、反复感染可导致ANCA水平升高，从形成高水平的ANCA到最终形成ANCA相关性小血管炎尚需要时间。

小血管炎；感染；慢性支气管炎；中性粒细胞保外网络

抗中性粒细胞胞浆抗体(Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相关性小血管炎(ANCA-associated vasculitides，AAV)是一组以小血管壁的炎症和纤维素样坏死为特征的系统性自身免疫性疾病，其血清中存在针对靶抗原蛋白酶3(PR3)或髓过氧化物酶的ANCA[1]，主要包括肉芽肿型多血管炎、显微镜下型多血管炎、嗜酸细胞性肉芽肿型多血管炎。AAV的发病机制目前仍不清楚，有研究报道63%的肉芽肿型多血管炎患者鼻腔中长期携带金黄色葡萄球菌，与疾病复发的风险密切相关[2,3]，在维持治疗期间接受复方新诺明抗菌治疗可以降低复发风险[4,5]。Kadowaki等[6]回顾性分析了国际上已报道的23例伴有长期慢性肺部感染的AAV患者，在AAV发生之前，18例有长期的慢性支气管扩张病史，3例有长期的弥漫性泛性细支气管炎病史，2例同时有慢性鼻窦炎及慢性支气管炎病史。

中性粒细胞外网络(Neutrophil Extracellular Traps，NETs)是机体在应答细菌感染的过程中由中性粒细胞释放的包含有核酸物质与髓过氧化物酶、蛋白酶3、抗菌肽LL-37、弹性蛋白酶等多种颗粒蛋白组成的细胞外网络[7]，因其可以捕获和杀伤细菌，在感染性疾病发生时，可在感染部位或血清中检测出NETs[8-10]。Nakazawa等[11]发现丙基硫氧嘧啶(Propylthiouracil，PTU)可导致NETs结构异常，从而使NETs降解减少，激发形成MPO-ANCA，诱导ANCA相关性小血管炎发生；Kessenbrock 等以及我们的前期研究都发现在AAV患者的肾组织受损部位有NETs的沉积[12，13]。

在上述研究的基础上，我们对2012年8月至2016年3月期间收治的42例AAV病人回顾性分析时竟发现有50%的病人在ANCA相关性小血管炎发病之前已有多年的慢性肺部疾病病史，其中10例为支气管扩张、11例为慢性支气管炎，患慢性肺部疾病的时间平均为(18.33±15.8)年。进一步提示长期慢性感染与ANCA相关性小血管炎之间有密切联系。因此，为进一步探讨慢性、反复感染、多次NETS刺激与ANCA相关性小血管炎之间的联系，我们建立了慢性支气管炎大鼠模型，给予NETs反复刺激，观察大鼠的免疫学变化，检测MPO-ANCA在此过程中形成的可能性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料 脂多糖(LPS)、佛波脂(PMA)、弗氏佐剂均购自Sigma-Aldrich公司，RPMI1640培养基购自Corning公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，抗瓜氨酸化的组蛋白H3抗体(ab5103)、抗MPO抗体(ab90810)均购自Abcam公司，Alex Fluor 488标记的羊抗兔IgG(bs-0295G-AF488)、Alex Fluor 647标记的羊抗小鼠IgG(bs-0296G-AF647)均购自北京博奥森生物技术有限公司，DAPI溶液购自北京索莱宝科技有限公司，大鼠髓过氧化物酶特异性抗中性粒细胞胞浆抗体(MPO-ANCA )ELISA Kit、大鼠瓜氨酸化的组蛋白H3(CitH3)ELISA Kit均购自Neoscientific公司，大鼠IFN-α ELISA Kit购自武汉华美生物工程有限公司。

1.1.2实验动物 8周龄清洁级雄性SD大鼠20只，体重180～200 g，购自青岛大任富城畜牧有限公司[scxkl(鲁)20140007]，饲养于青岛大学附属医院实验动物中心，温度控制在20℃～25℃，湿度控制在40%～70%，自由进食、进水，12 h光照周期。

1.2方法

1.2.1建立慢性支气管炎模型 初步将大鼠分为慢性支气管炎组和正常组。慢性支气管炎组于第1、15天给予气管内注入脂多糖，200 μg/只(1 mg/ml)，正常组给予气管内注入等体积PBS。慢性支气管炎组大鼠于第2～14天、第16～28天每天在有机玻璃烟熏箱内持续吸入哈德门香烟雾30 min，15支/次，2次/d，正常组不做处理。于第29天从2组中分别随机处死2只大鼠，取肺组织固定、石蜡包埋，行HE染色验证慢性支气管炎模型。

1.2.2提取大鼠中性粒细胞 大鼠腹腔提取中性粒细胞参照文献[12]。向大鼠腹腔内注射1 ml 4%的巯基乙酸盐，巯基乙酸盐可诱导大量中性粒细胞到腹腔中。2 h后，向大鼠腹腔内再次注射15 ml无菌PBS，后用空针回收，4℃，1 200 r/min 5 min离心，沉淀经PBS洗2次，最后用含5%FBS的RPMI1640培养基重悬计数。

1.2.3诱导中性粒细胞形成NETs 24孔板内预先置入多聚赖氨酸处理的细胞爬片，中性粒细胞按4×105个/ml接种至24孔板内，每孔0.5 ml。用100 nmol/L PMA处理细胞，对照组给予等体积PBS，于CO2培养箱中培养4 h。

1.2.4NETs的免疫荧光染色 细胞爬片经多聚甲醛固定、Triton X-100透膜、封闭液封闭后，用一抗(抗-H3Cit为1∶200，抗-MPO为1∶100)、二抗(浓度均为1∶200)进行免疫荧光染色，DAPI复染核。封片后激光共聚焦显微镜成像。

1.2.5NETs提取及免疫大鼠 将大鼠分为慢性支气管炎NETs刺激组(CB/NETs)、慢性支气管炎组(CB)、正常组。中性粒细胞按1×107个/瓶接种至培养瓶内，用100 nmol/L PMA处理细胞，于CO2培养箱中培养2 h，后收集瓶内所有物，4℃ 1 200 r/min 10 min离心，取沉淀溶于0.25 ml PBS，与等体积的弗氏佐剂混合，于第0、7、14、21天给予CB/NETs组大鼠皮下注射，其中第1次与完全弗氏佐剂混合，第2、3、4次与不完全弗氏佐剂混合。慢性支气管炎组及正常组给予注射等体积的PBS。于第28天留取血、尿后处死大鼠。

1.2.6标本采集 经代谢笼留取24 h尿液，检测尿常规和24 h尿蛋白定量，或于-80℃冻存备用；经眼眦静脉留取血标本，血标本经4℃ 3 000 r/min 10 min离心后取上清，于-80℃冻存备用。

1.2.7血、尿标本的检测 血清MPO-ANCA、瓜氨酸化的组蛋白H3的检测采用竞争法，IFN-α的检测采用双抗夹心法。严格按照试剂盒说明书操作，使用酶标仪于波长450 nm处测定OD值。通过绘制标准曲线计算标本中待测指标的浓度。肾功、尿常规和24小时尿蛋白定量于青岛大学附属医院检验科。

2 结果

2.1慢性支气管炎大鼠肺脏的病理变化 慢性支气管炎大鼠的肺部HE染色可见气管及支气管纤毛柱状上皮细胞部分坏死、脱落，纤毛变短，参差不齐；支气管黏液腺体增生、黏液细胞分泌增多；肌层可见各种炎性细胞浸润、充血、水肿和纤维增生，局部管壁塌陷、扭曲变形或扩张(图1)。

图1 慢性支气管炎大鼠肺组织HE染色(×20)Fig.1 Lung HE staining of chronic bronchitis rat(×20)

图2 NETs激光共聚焦显微成像(×40)Fig.2 Confocal laser scanning microscopy image of NETs(×40)

2.2免疫荧光染色鉴定NETs 激光共聚焦显微镜下，中性粒细胞在接受PMA刺激4 h后，产生大量细胞外网络结构，该结构由DNA、瓜氨酸化组蛋白H3及MPO等组成，从显微结构和组成成分上可鉴定为NETs(图2)。

2.3三组大鼠血清中MPO-ANCA水平的比较 CB/NETs组的血清MPO-ANCA水平为(62.497 5±19.637 64)ng/ml，而CB组的血清MPO-ANCA水平为(17.380 6±4.886 49)ng/ml，正常组的血清MPO-ANCA水平为(20.888 4±4.396 07)ng/ml，CB/NETs组血清MPO-ANCA水平明显高于CB组及正常组(图3)。

2.4三组大鼠瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)水平 CB/NETs组血清CitH3水平为(32.597 4±20.291 5) ng/ml，而CB组的血清CitH3水平为 (8.856 8±2.366 92)ng/ml，正常组的血清CitH3水平为(5.622 5±0.837 38)ng/ml CB/NETs组血清CitH3水平明显高于CB组及正常组(图4)。

图3 三组大鼠的血清MPO-ANCA水平Fig.3 Level of serum MPO-ANCA among groupsNote: *.P<0.01.

图4 三组大鼠的血清CitH3水平Fig.4 Level of serum CitH3 among groupsNote: *.P<0.01.

表1 肾脏相关指标的比较

图5 大鼠血清CitH3水平与血清MPO-ANCA水平相关性分析Fig.5 Relationship between serum MPO-ANCA with CitH3

2.5三组大鼠的血清IFN-α水平 CB/NETs组(n=6)的血清IFN-α水平与CB组(n=5)及正常组(n=4)相比，32.5(3 476.93)pg/ml、34(5.5)pg/ml、30(16.5)pg/ml，差异无统计学意义(P>0.05)。但CB/NETs组中有两只大鼠的血清IFN-α水平是明显升高的(3 735.7、3 428.4 pg/ml)。

2.6三组大鼠的肾脏评估结果 比较三组大鼠的血清肌酐、血清尿素氮、尿红细胞计数、24小时尿蛋白定量水平，差异无统计学意义(均P>0.05，表1)。

2.7相关性分析 大鼠血清CitH3水平与血清MPO-ANCA水平呈正相关(P<0.05，图5)。

3 讨论

AAV是一种累及全身多个器官的系统性自身免疫性疾病，ANCA被认为是诊断和监测AAV活动的一个重要的指标[14]。ANCA在ANCA相关性小血管炎中的致病性早已有明确的证据[15,16]。所以ANCA产生的源头性研究对探讨血管炎的发病机制具有重大意义。

有研究报道ANCA可存在于感染性心内膜炎、慢性丙型肝炎、肺结核等慢性感染性疾病中[17-20]，这表明ANCA的产生与感染相关。慢性支气管炎是气管、支气管黏膜及周围组织的慢性非特异性炎症，常伴随长期反复的肺部感染。Kobayashi等[21]报道在革兰阴性杆菌引起慢性肺部感染的患者中，可检测到杀菌/通透性蛋白(BPI)相关的ANCA。我们的前期研究发现在合并慢性支气管炎的AAV患者中，肽酰基精氨酸脱亚胺酶 4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)，NETs合成必需的酶，明显高于无血管炎的慢性支气管炎患者及健康人群[22]。我们对收治的AAV病人分析发现有50%的病人在ANCA相关性小血管炎发病之前已有多年的慢性肺部疾病病史，推测机体在反复、多次抗感染应答的过程中，释放大量NETs来捕获和杀伤细菌，在此过程中NETs中的颗粒抗原成分反复多次暴露，刺激机体免疫系统，引起免疫应答，最终产生相应的抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)。

目前已有研究通过给予相应的抗原刺激，成功建立了AAV的动物模型。Little等[23]通过用人MPO免疫MPO-ANCA基因敲除的大鼠，使大鼠产生MPO-ANCA，将其注入野生型大鼠体内，制造出同时累及了肺脏、肾脏的大鼠AAV模型；Yong等[24]用细菌的PR3同源蛋白诱导小鼠产生了PR3-ANCA。本研究中，我们首先建立起慢性支气管炎大鼠模型，再用PMA诱导中性粒细胞产生NETs，用NETs联合弗氏佐剂反复多次免疫慢性支气管炎大鼠。在给予大鼠NETs刺激4次后检测大鼠血清MPO-ANCA水平，结果表明CB/NETs组血清MPO-ANCA水平较CB组及正常组明显升高。同时，通过检测NETs的标志蛋白——瓜氨酸化的组蛋白H3(CitH3)来评估大鼠血清中NETs的水平，发现CB/NETs组血清CitH3水平较CB组及正常组明显升高，且血清CitH3升高水平与血清MPO-ANCA水平呈显著正相关，进一步说明NETs参与了诱导ANCA的产生。ANCA可与促炎症因子激活的中性粒细胞表面的MPO结合，导致更多中性粒细胞激活，释放更多NETs，从而形成了NETs与ANCA之间的恶性循环[25]。NETs中含有抗菌肽LL-37，是中性粒细胞分泌的一种内源性杀菌肽，可通过Toll样受体9(Toll like receptor-9，TLR-9)将自身DNA转换为能够激活浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendritic cells，pDC)的刺激性配体，刺激pDC产生IFN-α，IFN-α 亦可刺激中性粒细胞进一步释放NETs[26，27]。我们的前期研究证实在AAV患者血清中IFN-α的水平明显增高[28]。本实验中，我们再次比较了三组大鼠血清中IFN-α水平，发现CB/NETs组中有两只大鼠的血清IFN-α水平(3 735.7、3 428.4 pg/ml)与其他两组相比异常升高。提示在感染及NETs刺激下，这两只大鼠已发生了明显的免疫学异常，也进一步解释了CB/NETs组血清MPO-ANCA水平较CB组及正常组明显升高的原因。

遗憾的是在本研究中慢性支气管炎NETs组大鼠的肾功能、尿液分析、24小时尿蛋白定量暂时未见出现明显异常，分析可能与以下原因有关：①NETs独特的网络状结构可引起血管炎，促进血栓形成，使用DNase处理NETs后因降解了其网状结构从而可阻止血栓形成[29]。在本研究以NETs联合弗氏佐剂免疫大鼠，是发挥NETs中的抗原成分的免疫原性。NETs与弗氏佐剂混合过程中，NETs的网络状结构已被破坏而失去其直接致病性。②慢性支气管炎发展成AAV需较长的时间，且在整个病程中常伴有反复多次感染，而本实验在模拟过程中，仅给予大鼠4次NETs刺激，刺激时间较短，ANCA水平刚刚升高，还不足以导致器官损害。如想进一步观察器官损害，预计需要继续更长时间给予刺激。但本研究中，在慢支模型的基础上，经四次刺激后，因担心大鼠死亡而未无限地延长观察与刺激时间。

综上，我们推测慢性支气管炎反复感染过程中可释放大量NETs，其内含有的MPO抗原等反复多次暴露，可刺激机体产生相应的抗中性粒细胞胞浆抗体。

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[收稿2017-04-19 修回2017-06-28]

(编辑 许四平 刘格格)

NeutrophilextracellulartrapsinduceproductionofMPO-ANCAinchronicbronchitisrats

LIHui,XINGGuang-Qun.
DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266555,China

Objective:To investigate the mechanism of chronic bronchitis with recurrent long duration infections in the production of MPO anti-neutrophil cytoplasmic antibodies(ANCA).MethodsRats were gave intratracheal injection of LPS and smoked to established chronic bronchitis(CB)model.Rat neutrophils were incubated with phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)to induce Neutrophil extracellular traps(NETs).NETs were then used to immune chronic bronchitis rats.Serum concentrations of myeloperoxidase anti-neutrophil cytoplasmic antibodies(MPO-ANCA),Citrullinated Histone H3(CitH3),Interferon-α(IFN-α)were evaluated.Results(1)The serum levels of MPO-ANCA in chronic bronchitis rats immuned with NETs(CB/NETs)were significantly higher than those in chronic bronchitis rats(CB)and healthy control rats,(62.497 5±19.637 64)ng/ml vs (17.380 6±4.886 49)ng/ml,(20.888 4±4.396 07)ng/ml(bothP<0.01).(2)The serum levels of CitH3 in CB/NETs rat were significantly higher than those in CB rat and healthy control rats,(32.597 4±20.291 5)ng/ml vs (8.856 8±2.366 92)ng/ml,(5.622 5±0.837 38)ng/ml(P<0.05，P<0.01).(3)The serum levels of IFN-α were found increased sharply in two CB/NETs rats(3 735.7,3 428.4 pg/ml).(4)Renal function among three groups showed no significant difference yet.(5)Serum CitH3 level showed a positive correlation with serum MPO-ANCA level(r=0.61，P<0.05).ConclusionChronic bronchitis with recurrent infections could induce the production of ANCA probably by the stimulation of NETs,but whether it might develop to AAV remains need a duration.

Small vessel vasculitis;Infection;Chronic bronchitis;Neutrophil extracellular Traps

①本文受国家自然科学基金(纵向：81770699)、山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0176)和青岛市科技局成果转化计划科技惠民专项(纵向：15-9-2-90-nsh)资助。

R593.2

A

1000-484X(2017)10-1458-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.004

李 慧(1992年-)，女，在读硕士，主要从事自身免疫性肾病方面的研究，E-mail:13954495475@163.com。

及指导教师：邢广群(1970年-)，女，博士，教授，主任，硕士生导师，主要从事自身免疫性肾病方面的研究，E-mail:gqx99monash@163.com。