黄曲霉毒素M1酶联免疫吸附检测方法的建立*

2017-10-23 01:37卢晓霞谢海军何永吉
食品工程 2017年2期
关键词:黄曲霉单克隆毒素

卢晓霞 谢海军 宋 崴 赵 邑 何永吉,2***(

1山西省生物研究所,山西太原 030006)(2山西省农业科学院农产品加工研究所,山西太原 030006)

黄曲霉毒素M1酶联免疫吸附检测方法的建立*

卢晓霞1**谢海军1宋 崴1赵 邑1何永吉1,2***(

1山西省生物研究所,山西太原 030006)(2山西省农业科学院农产品加工研究所,山西太原 030006)

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉(Aspergillus flavus) 和寄生曲霉(A.parasiticu)产生的小分子代谢产物,具有很强的致癌、致畸、致突变作用,严重威胁食品安全。黄曲霉毒素具有6种结构极为接近的类型,分别为B1、B2、G1、G2、M1和M2型。其中黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)主要存在于蛋、奶中,是黄曲霉毒素B1的次级羟基化代谢物,高温等常规操作难以将其破坏,具有很大的危害性,是目前食品污染监测的重点。

酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法具有快速、敏感、易于标准化的优点,是目前检测AFM1的首选方法。目前已建立多种检测AFM1的ELISA方法,然而仍无法满足国际上对AFM1限量标准不断更新的要求,并存在敏感性差、操作繁琐、标准化程度低等诸多问题。本研究通过合成AFM1-KLH和AFM1-OVA完全抗原,分别制备了AFM1单克隆抗体和多克隆抗体,并利用单克隆抗体和多克隆抗体建立夹心ELISA定量检测方法,为深入研究AFM1的生物学功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1和G2标准品,弗氏免疫佐剂,抗体亚类鉴定试剂盒,Sigma公司;钥孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、AP标记的羊抗鼠 IgG、PEG1500、邻苯二胺 (OPD)、NBT/BCIP显色剂,南京金斯瑞公司;健康雌性Balb/c小鼠及新西兰大白兔,北京维通利华实验动物有限公司。其他常规试剂全部为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 AFM1半抗原、完全抗原合成

按照参考文献[3]中的方法,采用琥珀酰亚胺法将AFM1转化成AFM1肟化物(AFM1O)半抗原,然后利用碳化二亚胺法(EDC)与载体蛋白KLH和OVA反应,有机合成完全抗原AFM1-KLH和AFM1-OVA。

1.2.2 AFM1单克隆抗体制备

按照经典杂交瘤技术方法,以AFM1-KLH为免疫抗原,采用标准免疫程序免疫5周龄健康雌性Balb/C小鼠,以AFM1-KLH作为包被抗原,采用间接ELISA法监测免疫效果;采用PEG1500化学法完成免疫后脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的细胞融合,以 AFM1-OVA为筛选抗原,联合间接ELISA方法和有限稀释法筛选阳性克隆,最后采用扩大培养方法生产单克隆抗体。上清经ProteinA亲和柱层析后收集洗脱液,利用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定。

1.2.3 AFM1多抗血清的制备

AFM1-KLH作为免疫抗原,按照标准免疫程序,分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分乳化后,经皮下多点免疫。初次免疫量控制在0.8 mg/只,其余3次免疫量均减半,8周后从颈动脉采全血。以AFM1-OVA为包被抗原,按照间接ELISA法检测血清效价。收获的抗血清交换至磷酸缓冲液(PBS)后,同样采用ProteinA亲和柱层析分离纯化收集洗脱液,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定。

1.2.4 双抗体夹心ELISA方法的建立

制备的AFM1单克隆抗体经碳酸盐包被液包被后,铺96孔板,100 μL/孔;次日经PBST(即PBS缓冲液中加入吐温-20配制而成)洗涤后加入5%脱脂奶粉封闭液封闭;洗涤后加入AFM1-OVA标准蛋白或者待测样品,37℃孵育反应1 h;加入AFM1兔多抗,100 μL/孔,37℃孵育反应1 h;加入商品化的HRP标记的羊抗兔IgG,100 μL/孔,37℃孵育反应1 h;加入TMB底物显色液,室温下避光反应,加入30 μL/孔、2 mol/L H2SO4终止反应后,于450 nm处测定。

1.2.5 ELISA反应条件优化

采用方阵滴定法对包被单克隆抗体浓度、兔多抗浓度、酶标二抗稀释度进行优化。

1.2.6 标准曲线建立

以优化的 ELISA参数为试验条件,以AFM1-OVA为标准蛋白,依次测定标准蛋白质量浓度为0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、8.0 ng/mL、16.0 ng/mL、32.0 ng/mL、64.0 ng/mL、128.0 ng/mL、256.0 ng/mL时在450 nm处的光密度(OD)值,以AFM1-OVA标准蛋白浓度为横坐标,450 nm处的OD值为纵坐标建立标准曲线。分析标准曲线的检测范围、最低检测限、批间和批内变异系数,对所建立的ELISA方法进行综合评价。

1.3 结果

1.3.1 AFM1单克隆抗体的制备及鉴定

采用细胞融合技术获得一株可稳定分泌抗AFM1抗体的杂交瘤细胞株,经Western blot检测该抗体可以特异性结合AFM1抗原,结果见图1。抗体亚类鉴定结果显示该抗体属IgG1。经体外细胞培养产生抗体后,其效价可达1∶5×103。细胞培养上清经 Protein ng/mL A亲和层析纯化后,经SDS-PAGE检测,结果见图2。由图2可知,利用体外细胞培养,并经亲和层析纯化后,可获得较纯的AFM1单抗。

1.3.2 AFM1多克隆抗体的制备及鉴定

以AFM1-KLH免疫新西兰大白兔收获多抗血清后,经Protein A柱分离纯化(见图2),抗体效价可达1∶105,由Western blot检测结果可知,其同样具有特异性识别AFM1抗原的能力,且无其他假阳性结果出现(见图1)。

图1 Western blot检测单抗和多克隆抗体的特异性

图2 SDS-PAGE检测单抗和多抗

1.3.3 标准曲线的建立

方阵滴定法确定了ELISA各反应最优条件,以AFM1-OVA为标准蛋白建立了标准曲线,结果见图3。其标准曲线方程为 y=0.004 4x+0.002 1(R2= 0.992 2),其中x为AFM1-OVA标准蛋白质量浓度、y为OD450值,工作范围为0.5 ng/mL~128 ng/mL;批内、批间差分别为6.21%和5.23%,均小于10%,重复性良好,最低检测限为0.5 ng/mL。

图3 夹心ELISA法的标准曲线

3 讨论

AFM1作为一种目前奶制品最为重要的检测项目之一,其检测结果直接关系到奶制品的质量安全,因此,急需建立一种可以适应监管一线的方法,从而快速、准确、简便地完成对AFM1的监测。利用ELISA方法完成AFM1检测是目前该领域的主要方向之一。而ELISA检测的关键是获得具有特异性的高活性抗体,包括单克隆抗体和多克隆抗体。目前关于AFM1单克隆抗体和多克隆抗体的制备已多有报道,然而其特异性、敏感性以及稳定性均差强人意。建立一种可适用于生产实际的应用性检测方法,不仅要选择标准化的检测抗原建立标准曲线,而且要选择具有高度特异性的抗体来防止假阳性的出现,同时要经过优化筛选提高方法的准确度和重复性,才能真正建立一种具有实际可操作性的ELISA检测方法。

本研究制备了完全抗原AFM1-KLH、AFM1-OVA,大大提高了抗原的免疫原性,通过双抗原结合制备了高特异性的单克隆抗体,降低了与其他黄曲霉毒素种类的交叉反应性;通过免疫新西兰大白兔,制备了与单克隆抗体不同种属的多克隆抗体;最终通过ELISA方阵滴定法优化试验条件,建立了敏感、准确、标准化的单抗-多抗夹心ELISA方法,为替代国外进口试剂,研发自主知识产权的AFM1检测试剂奠定基础。

[1]YOSHIZAWA T,YAMASHITA A,LUO Y.Fumonisin occurrence in cornfrom high and low risk areas for human esophageal cancerin China[J].Appl Environ Microbiol,1994,60(5):1 626-1 629.

[2]裴世春,郑丽娜,唐彦君,等.黄曲霉毒素M1检测ELISA条件的优化及应用研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2008,20(5):57-60.

[3]王勇.黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究[J].大众标准化,2016(4):61-63.

Development of enzyme-linked immunosorbent assay for AFM1detection*

LU Xiaoxia1**XIE Haijun1SONG Wei1ZHAO Yi1HE Yongji1,2***1(Biology institute of Shanxi,Shanxi Taiyuan 030006,China)
2(Institute of agricultural products processing,Shanxi academy of agricultural sciences,Shanxi Taiyuan 030006,China)

建立单抗-多抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)检测方法,为黄曲霉毒素M1(AFM1)的快速检测及研究奠定基础。采用有机合成法将AFM1转化成半抗原AFM1肟化物(AFM1O),进一步与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)偶联合成完全抗原AFM1-KLH和AFM1-OVA;以AFM1-KLH为免疫抗原、AFM1-OVA为筛选抗原,采用杂交瘤技术制备AFM1单克隆抗体,以AFM1-KLH免疫新西兰大白兔制备兔多克隆抗体;以AFM1-OVA为标准蛋白,制备的单克隆抗体为捕获抗体,纯化的兔多克隆抗体为检测抗体,商品化HRP标记的山羊抗兔IgG作为检测二抗,采用方阵滴定法优化各步检测条件,得到最佳试验条件,建立AFM1夹心ELISA检测方法。标准曲线方程为y=0.004 4x+0.002 1(R2=0.992 2),检测范围0.5 ng/mL~128 ng/mL;最低检测限为0.5 ng/mL,批内和批间差均小于10%,重复性良好。

AFM1;抗体;ELISA

Objective development of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for detection of AFM1.Methods the hapten AFM1O was synthesized from derivatives of AFM1by a chemical process.Further,complete antigen AFM1-KLH and AFM1-OVA were synthesized by couple AFM1with KLH and OVA respectively.AFM1-KLH and AFM1-OVA were subsequently used as immunogen and detecting antigen to screen mAb produced by hybridoma cells agains and pcAb produced from antiserum.Then a sandwich ELISA for determination of AFM1was developed using the AFM1-OVA as standard protein,in which the monoclonal and ployclonal antibody previously produced were chosen as a capture antibody and detect antibody,respectively.The results showed the standard linear equation,y=0.004 4x+0.002 1(R2=0.992 2),was established for the determination of AFM1concentration with the valid rang of 0.5~128ng/mL.The susceptibility of the ELISA was about 0.5 ng/mL of AFM1concentration.

AFM1;antibody;ELISA

TS207

A

1673-6044(2017)02-0058-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.02.016

山西省应用基础研究项目(201601D102041)。

**卢晓霞,女,1984年出生,2004年毕业于山西大学生物工程专业,助理研究员。

***何永吉,通讯作者,E-mail:heyongji_919@163.com.

2017-03-03

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